Roux-en-Y胃旁路術(shù)對(duì)2型糖尿病大鼠肝臟和腸道糖異生影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、糖尿病是在世界各地日益嚴(yán)重的健康問題和主要的慢性疾病。國(guó)際糖尿病聯(lián)合會(huì)(International Diabetes Federation，IDF)估計(jì)，到2014年全球?qū)⒂?.87億人患有糖尿病，而到2035年這一數(shù)字將上升到5.92億。糖尿病及其相關(guān)并發(fā)癥將導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和死亡率，糖尿病并發(fā)癥包括心臟疾病、中風(fēng)、糖尿病足、糖尿病視網(wǎng)膜病變和糖尿病腎病等。在2014年，糖尿病引起的醫(yī)療支出至少6120億美元，占成人總醫(yī)療支出的11

2、％。此外，在2014年糖尿病引起了490萬例患者死亡，這意味著每七秒就有一糖尿病患者死亡。因此，尋找新的和有效的治療糖尿病的方法是非常重要和緊迫的。
　　2型糖尿病(type2 diabetes mellitus，T2DM)，以胰腺胰島細(xì)胞分泌胰島素功能減退合并胰島素敏感靶器官有害的胰島素抵抗為特征，約占所有糖尿病的90％。目前，治療T2DM的主要方法包括生活方式干預(yù)、藥物和減重手術(shù)。越來越多的證據(jù)表明減重手術(shù)是目前治療伴肥胖T2

3、DM最有效的方法，它能迅速而持續(xù)地減輕體重，以及顯著改善甚至完全緩解T2DM。隨著糖尿病患病率逐年上升，過去10年中在全球進(jìn)行減重手術(shù)的總數(shù)也不斷增加。2013年，全世界最常見的減重術(shù)式依次是Roux-en-Y胃旁路術(shù)(Roux-en-Y gastric bypass，RYGB)，約占所有減重手術(shù)的45％，其次為袖狀胃切除術(shù)(sleeve gastrectomy,SG)，約占總數(shù)的37％，以及可調(diào)節(jié)胃束帶術(shù)(adjustable gas

4、tric banding，AGB)，約占總數(shù)的10％。RYGB術(shù)后食物流通過小胃囊排入中段空腸，膽胰液轉(zhuǎn)流到遠(yuǎn)端空腸，被證明能長(zhǎng)期有效地減輕體重并且緩解諸如血脂異常、高血壓、脂肪肝、糖尿病腎病和視網(wǎng)膜病等糖尿病并存病，故其被認(rèn)為是減重手術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)術(shù)式。然而，介導(dǎo)RYGB后抗糖尿病作用的內(nèi)在機(jī)制仍然知之甚少。
　　RYGB抗糖尿病效應(yīng)的一些潛在作用機(jī)制包括激素分泌、腸道菌群和膽汁酸循環(huán)的改變等。累積的證據(jù)表明，RYGB后由于腸道早期暴

5、露于未充分消化的食糜，小腸出現(xiàn)形態(tài)學(xué)適應(yīng)和葡萄糖代謝功能重構(gòu)，這可能是減重手術(shù)治療糖尿病的作用機(jī)制。近期，腸道糖異生參與調(diào)控葡萄糖穩(wěn)態(tài)的一種新的功能被提出，這一功能被認(rèn)為可能是減重手術(shù)治療糖尿病的作用機(jī)制。盡管肝臟和腸道糖異生功能得到了確認(rèn)和較多的研究，然而糖異生在RYGB治療糖尿病中的作用還沒有定論。
　　目的:
　　在T2DM大鼠模型中觀察RYGB對(duì)葡萄糖穩(wěn)態(tài)、脂質(zhì)代謝、血清膽汁酸水平、腸道形態(tài)適應(yīng)以及肝臟和腸道糖異生的

6、影響。本次研究的結(jié)果可能為闡明RYGB緩解糖尿病的潛在代謝機(jī)制提供新的見解。
　　方法:
　　1、動(dòng)物與飼養(yǎng)條件
　　該動(dòng)物研究獲得了上海市第六人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審核通過。三十只6周齡雄性SD大鼠購(gòu)自中英Sippr/BK實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司（上海，中國(guó)）。所有動(dòng)物保持在12小時(shí)光照/黑暗周期控制環(huán)境溫度(24±2℃)和濕度的單個(gè)籠中。所有的大鼠自由進(jìn)食自來水和飼料，除非另有說明。經(jīng)過2周適應(yīng)后，30只大鼠喂食高脂肪

7、飼料(high-fat diet，HFD)（60％脂肪，20％碳水化合物，20％蛋白質(zhì)，熱量總百分比;Research Diets，Inc.，美國(guó)）4周以誘發(fā)胰島素抵抗。高脂喂養(yǎng)后大鼠禁食12小時(shí)，腹腔注射1％鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ;35mg/kg)（Sigma公司，美國(guó)）以誘發(fā)糖尿病狀態(tài)。STZ注射七十二小時(shí)后，采集尾靜脈血液用血糖儀（Sinocare公司，中國(guó)）兩次測(cè)定非空腹血糖。非空腹血糖≥16.7 mm

8、ol/L的大鼠被認(rèn)為是T2DM大鼠，T2DM大鼠被隨機(jī)分配到假手術(shù)組（Sham group，n=10）和RYGB組(RYGB group，n=10)。所有大鼠注射STZ后以普通飼料（10％脂肪，70％碳水化合物，20％蛋白質(zhì)，熱量總百分比;Research Diets，Inc.，美國(guó)）喂養(yǎng)。注射STZ一周后，對(duì)假手術(shù)組和RYGB組大鼠進(jìn)行相應(yīng)假手術(shù)或RYGB手術(shù)。在所有組中，體重和食物攝入量在手術(shù)后2周內(nèi)每天測(cè)量1次，隨后剩下時(shí)間每2周

9、一次。用血糖儀測(cè)量各組大鼠空腹血糖，術(shù)后2周內(nèi)每周1次，隨后每2周一次。
　　2、手術(shù)方法
　　禁食24小時(shí)后，以1％戊巴比妥鈉溶液腹腔內(nèi)注射（5 ml/kg）對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉。RYGB術(shù)以長(zhǎng)約4cm的正中切口開腹，在胃食管交界處下方5mm從小彎側(cè)到大彎側(cè)將胃水平橫斷。近端胃以4-0絲線（寧波醫(yī)用針線，中國(guó)）單純間斷縫合關(guān)閉創(chuàng)建一個(gè)小胃囊，遠(yuǎn)端殘余胃以相同的方法縫合關(guān)閉。在Treiz韌帶下方10厘米橫斷空腸，兩側(cè)斷端以4-0絲

10、線結(jié)扎。將遠(yuǎn)端空腸拉到小胃囊處，分別在腸對(duì)系膜緣和近胃大彎胃前臂處切開7mm小口，小胃囊與遠(yuǎn)端空腸以側(cè)側(cè)胃腸吻合的方式連接。攜帶膽胰液的近端空腸與Roux支在胃腸吻合口下方15cm處以側(cè)側(cè)空腸空腸吻合的方式重新連接。胃腸吻合和空腸空腸吻合均用5-0絲線（寧波醫(yī)用針線，中國(guó)）以單純間斷內(nèi)翻縫合方式進(jìn)行，形成約7mm的吻合口。假手術(shù)組大鼠進(jìn)行相同的開腹，在與RYGB手術(shù)相同位置進(jìn)行胃腸橫斷，并在原來位置吻合，以產(chǎn)生與RYGB相同的手術(shù)和麻醉

11、應(yīng)激效果。
　　手術(shù)大鼠在術(shù)后24小時(shí)開始給予葡萄糖氯化鈉溶液喂養(yǎng)，在術(shù)后4天開始恢復(fù)普通飼料（10％脂肪，70％碳水化合物，20％蛋白質(zhì)，熱量總百分比;Research Diets，Inc.，美國(guó)）喂養(yǎng)。
　　所有大鼠在術(shù)后8周禁食一晚后處死?？漳c（在假手術(shù)組為屈氏韌帶下約17厘米近端空腸，在RYGB組對(duì)應(yīng)空腸滋養(yǎng)支中間段）、回腸（距離回盲部約10厘米處）和肝臟活組織一份在福爾馬林中固定用于常規(guī)組織學(xué)檢查，另一份經(jīng)液氮冷卻

12、后儲(chǔ)存在-80℃用于實(shí)時(shí)定量RT-PCR和蛋白免疫印跡。
　　3、口服葡萄糖耐量試驗(yàn)
　　在術(shù)前、術(shù)后2周和8周進(jìn)行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)。大鼠禁食一晚后，以20％葡萄糖(1g/kg)灌胃。使用血糖儀測(cè)量空腹以及灌胃后30、60、90和120min血糖。
　　4、胰島素耐量試驗(yàn)
　　在術(shù)前、術(shù)后2周和8周進(jìn)行胰島素耐量試驗(yàn)(ITT)。大鼠禁食一晚后，腹腔注射人胰島素（0.5 IU/kg）。采尾靜脈血測(cè)量清

13、醒大鼠空腹以及注射胰島素后30、60、90和120min血糖。
　　5、血清脂質(zhì)和總膽汁酸檢測(cè)
　　晚上禁食后，分別于術(shù)前及術(shù)后2周、8周采集清醒大鼠空腹尾靜脈血樣到含有EDTA溶液的冷卻管。在4℃離心(1006×g)15分鐘后，立即提取血清并存儲(chǔ)在-80℃?zhèn)溆?。血清總膽固?TC)、甘油三酯(TG)、游離脂肪酸(FFAs)和總膽汁酸根據(jù)使用說明用酶比色檢測(cè)試劑盒測(cè)量。
　　6、組織學(xué)分析
　　每只大鼠的空腸和回

14、腸組織標(biāo)本用石蠟包埋后切片。將切片用蘇木精和伊紅(H&E)染色，通過光學(xué)顯微鏡觀察。對(duì)于腸道形態(tài)適應(yīng)的評(píng)價(jià)，由一位獨(dú)立的病理專家在顯微鏡下觀察(×100)所有組織切片后進(jìn)行評(píng)估。
　　結(jié)果:
　　1、空腹血糖水平
　　RYGB組和假手術(shù)組大鼠術(shù)前空腹血糖水平?jīng)]有差別。假手術(shù)組大鼠術(shù)后空腹血糖逐漸升高，而RYGB組大鼠術(shù)后空腹血糖增長(zhǎng)緩慢，并且于術(shù)后1周開始保持平穩(wěn)。術(shù)后4周開始，RYGB組大鼠空腹血糖水平顯著低于假手術(shù)

15、組。
　　2、體重和攝食量
　　RYGB組和假手術(shù)組大鼠術(shù)前體重和攝食量沒有差別。兩組大鼠于術(shù)后1周體重下降到最低，假手術(shù)組大鼠體重于術(shù)后2周恢復(fù)到術(shù)前水平，而RYGB組大鼠從術(shù)后2周開始體重增長(zhǎng)變緩。術(shù)后3周開始直至術(shù)后8周，RYGB組大鼠體重顯著低于假手術(shù)組。術(shù)后2周開始直至術(shù)后8周，RYGB組大鼠攝食量顯著低于假手術(shù)組。
　　結(jié)論:
　　1、RYGB能顯著減輕T2DM大鼠模型的體重，并顯著減少其攝食量。