熱休克蛋白47在腎臟纖維化中的作用及機制研究.pdf

1、背景：
　　 腎纖維化是指在各種致病因子如炎癥、損傷等作用下，間質細胞及細胞間質增多，尤其是基質蛋白合成增加，基質降解受抑制造成細胞外基質(Extracellular matrix，ECM)的大量堆積導致的腎小球硬化和小管間質纖維化。它是多種慢性腎臟疾病最終導致腎功能衰竭的主要病理改變和共同通路，延緩和防止腎纖維化是防治慢性腎臟病進展的關鍵。膠原是ECM的主要成分，在各種腎臟纖維化疾病中合成都顯著增高，它合成和沉積增加與腎臟纖維

2、化的啟動和進展有密切關系。
　　 熱休克蛋白47(Heat shock protein47，HSP47)是一種膠原特異性的“分子伴侶”，在膠原生物合成過程中協(xié)助前膠原修飾、折疊、裝配，是膠原成熟的必要條件，其表達影響膠原產(chǎn)量。HSP47在多種腎臟纖維化的動物和臨床疾病研究中包括高血壓腎硬化模型大鼠，5/6腎臟切除大鼠模型，人類IgA腎病及糖尿病腎病腎組織等，表達都明顯增高，且與膠原同步增加。并初步證實動物體內抑制其表達可減輕纖維

3、化的程度，如HSP47反義寡聚脫氧核苷酸轉染抗Thy-1腎小球腎炎大鼠，HSP47 siRNA轉染UUO大鼠，都可以改善腎纖維化，提示HSP47在腎臟纖維化中的作用可能并不局限于調節(jié)膠原的合成。
　　 絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路是介導細胞反應的重要信號系統(tǒng)，能將細胞外信號轉導至細胞及其核內，通過保守的三級級聯(lián)反應(MAPKKK—MAPKK-MAPK)激

4、活轉錄因子，調節(jié)基因表達。細胞外調節(jié)蛋白激酶(extracellularsignal-regulated kinase， ERK1/2)和c-Jun氨基末端激酶(c-JunNH2-terminal kinase，JNK)是它的兩個主要家族成員。其中ERK1/2又被稱為絲裂原活化的MAPK通路，主要功能是介導促進細胞增殖和分化；JNK主要功能是調節(jié)參與機體應激反應。體外實驗證明ERK1/2，JNK信號傳導通路可介導外界刺激所致的熱休克蛋白

5、合成。
　　 基于以上分析得知HSP47是膠原合成的特異性“分子伴侶”，其在腎臟纖維化中表達增高，且有促腎臟纖維化作用，但其作用機制可能不局限于對膠原合成的調控，MAPK信號傳導通路可能參與調控HSP47的表達。為此，本實驗開展如下的研究。
　　 目的：
　　 利用單側輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction，UUO)大鼠模型，初步觀察HSP47在腎臟組織的表達情況，旨在探討HS

6、P47在腎小管間質纖維化中的作用。
　　 方法：
　　 SD大鼠隨機分為模型組(UUO組)和假手術組(Sham組)，每組8只。采用單側(左)輸尿管結扎方法，建立梗阻性腎小管間質纖維化大鼠模型，Sham組只游離輸尿管而不結扎。術后14天處死動物，取結扎側腎臟，同時處死假手術組大鼠，取出腎組織。觀察各組之間蛋白尿，血肌酐水平，運用HE，Masson染色觀察腎臟組織形態(tài)學改變，采用免疫組化方法檢測HSP47、膠原Ⅳ(Colla

7、genⅣ)與纖維連接蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)表達的部位和變化。
　　 結果：
　　 1.與假手術組比較，UUO模型組大鼠血肌酐水平升高，蛋白尿無顯著差異。
　　 2.與假手術組比較，光鏡下UUO模型組大鼠腎組織出現(xiàn)不同程度的腎小管擴張、間質炎癥細胞浸潤，間質面積增寬、部分腎小管萎縮、腎小管上皮細胞空泡樣變性。
　　 3.Masson染色結果顯示：與假手術組比較，UUO模型組大鼠腎組織膠原在腎小

8、管周圍、間質區(qū)顯著增多。
　　 4.免疫組化結果顯示：與假手術組比較，UUO模型組大鼠腎組織HSP47表達顯著增加，在腎小管周圍、間質區(qū)表達增加最明顯；CollagenⅣ表達顯著增加，在腎小管基底膜、間質區(qū)表達增加最明顯；FN表達顯著增加，主要表達在腎間質區(qū)。
　　 結論： HSP47在UUO大鼠模型腎臟組織表達上調，且與膠原表達部位一致，提示HSP47促進腎間質纖維化，且該作用與其促進膠原蛋白的合成有關。
　　

9、 目的：
　　 研究HSP47在TGF-β1誘導HK-2細胞合成Collagen及FN等ECM蛋白過程中的作用，并檢測其對PAI-1表達的影響，探討HSP47在ECM合成與降解平衡中的角色。
　　 方法：
　　 常規(guī)培養(yǎng)HK-2細胞，分為對照組、TGF—β1組、HSP47siRNA組，對照組為無血清DMEM組，TGF-β1組為TGF-β1誘導，HSP47siRNA組為HSP47siRNA與TGF-β1共同作用，R

10、T-PCR檢測HSP47、collagenⅣ、FN、PAI-1的mRNA表達，Western Blot檢測HSP47、collagenⅣ、FN蛋白表達，ELISA檢測PAI-1的蛋白表達。
　　 結果：
　　 1.常規(guī)培養(yǎng)的HK-2可表達HSP47，不同濃度TGF-β1(0、2.5、5、10ng/ml)干預不同時間(12h、24h、48h)，HSP47基因和蛋白表達都呈逐漸增高的趨勢，10ng/ml TGF—β1干預HK

11、-2細胞48h時HSP47在基因和蛋白水平上都表達最強。
　　 2.不同濃度TGF—β1(0、5、10ng/ml)干預HK-2不同時間(12h、24h、48h)，collagenⅣ、FN、PAI-1在基因，蛋白水平表達呈逐漸增高的趨勢，TGF-β1(10ng/ml)作用48小時三者基因和蛋白水平表達最強。
　　 3.HSP47siRNA組(HSP47siRNA處理24h，再TGF—β110ng/ml干預48)與TGF-β

12、110ng/ml干預48h比較，前者HSP47，collagenⅣ，F(xiàn)N，PAI-1mRNA和蛋白的表達都明顯下調。
　　 結論：
　　 1.TGF-β1呈濃度和時間依賴模式上調HK-2細胞HSP47的表達。
　　 2.TGF—β1呈濃度和時間依賴模式上調HK-2細胞collagenⅣ，F(xiàn)N，PAI-1表達。3.HSP47siRNA可以下調TGF—β1誘導下HK-2細胞分泌的collagenⅣ、FN、PAI-1的

13、mRNA和蛋白表達。
　　 目的：
　　 研究絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)途徑是否介導了TGF-β1誘導HK-2細胞上調HSP47表達。
　　 方法：
　　 應用ERK、JNK特異性抑制劑觀察對TGF—β1誘導HK-2細胞上調HSP47表達的影響
　　 結果：
　　 應用PD98059、SP600125分別特異性抑制MAPK途徑的胞外信號調節(jié)蛋白激酶(ERK1/2)、c—Jun-氨基末端

14、激酶(JNK)通路，對TGF-β1上調HSP47的作用有不同影響。
　　 1.PD98059可以抑制TGF-β1對HK-2細胞ERK信號通路的活化和HSP47的表達，且不同濃度PD98059(25uM、50uM、7SUM)對HSP47的抑制效果有差異。
　　 2.SP600125可以抑制TGF—β1對HK-2細胞JNK信號通路的活化和HSP47的表達，且不同濃度SP600125(10uM、20uM、30uM)對HSP47