單細(xì)菌水平毒素抗毒素系統(tǒng)研究新方法.pdf

1、細(xì)菌的抗藥性危害日益嚴(yán)重，毒素-抗毒素(TA)系統(tǒng)在細(xì)菌內(nèi)的異質(zhì)性表達(dá)是多藥耐受性存留細(xì)胞形成的重要原因。闡明致病菌中毒素-抗毒素系統(tǒng)的作用機(jī)理和生理功能對(duì)研發(fā)防控致病菌的新策略和疾病診斷治療等具有重要意義。目前，對(duì)TA系統(tǒng)的研究主要集中在基因水平或轉(zhuǎn)錄水平，而傳統(tǒng)基于蛋白質(zhì)水平的檢測(cè)方法，如Western Blot等都是對(duì)大量細(xì)菌裂解液中的毒素抗毒素蛋白進(jìn)行檢測(cè)，是大量細(xì)菌內(nèi)毒素抗毒素蛋白表現(xiàn)的集權(quán)平均。對(duì)單細(xì)菌水平的毒素-抗毒素蛋白

2、進(jìn)行快速逐一分析可揭示因集權(quán)平均而被掩蓋的個(gè)體差異，有益于TA系統(tǒng)的異質(zhì)性考察及亞類表征。
　　本論文旨在將雙砷染料-四半胱氨酸體系與免疫熒光技術(shù)聯(lián)用，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室自行研制的超高靈敏流式細(xì)胞儀（high sensitivity flow cytometry, HSFCM），通過(guò)對(duì)單細(xì)菌水平毒素和抗毒素的同時(shí)檢測(cè)，發(fā)展TA系統(tǒng)研究新方法，建立單細(xì)菌水平毒素、抗毒素蛋白定量表征技術(shù)并考察各參數(shù)之間的相互關(guān)系;建立TA系統(tǒng)在不同應(yīng)激條件下

3、的超高靈敏檢測(cè)模式，確定TA系統(tǒng)在誘發(fā)細(xì)菌程序性阻滯和程序性死亡中的作用;引入雙質(zhì)粒體系，考察Lon蛋白對(duì)TA系統(tǒng)調(diào)控的單細(xì)菌水平檢測(cè)的可行性，為考察TA系統(tǒng)間交互作用并發(fā)展方便、快捷的毒素蛋白誘導(dǎo)因子篩選方法墊定基礎(chǔ)。本研究發(fā)展了單細(xì)菌水平、原位、高通量、普適性的TA系統(tǒng)研究新方法，對(duì)揭示TA系統(tǒng)的作用機(jī)理和研究對(duì)抗致病菌及細(xì)菌耐藥性的戰(zhàn)略具有重要價(jià)值。
　　論文第一章為文獻(xiàn)綜述。重點(diǎn)介紹了毒素抗毒素系統(tǒng)現(xiàn)有的研究方法和單細(xì)菌水

4、平研究TA系統(tǒng)的重要性及超高靈敏流式檢測(cè)裝置在細(xì)菌檢測(cè)中的應(yīng)用。本章的最后介紹了本論文的選題思路和主要研究?jī)?nèi)容。
　　論文第二章我們以MqsR/MqsA TA系統(tǒng)為研究對(duì)象，構(gòu)建了毒素帶TC標(biāo)簽和抗毒素帶TC標(biāo)簽的重組體系。通過(guò)對(duì)染色方法、染色時(shí)間、染料濃度等的優(yōu)化，經(jīng)HSFCM檢測(cè)，天然啟動(dòng)子下抗毒素及毒素帶TC標(biāo)簽實(shí)驗(yàn)組與不帶TC標(biāo)簽的陰性對(duì)照組的TC-FlAsH熒光信號(hào)可以明顯區(qū)分，成功建立了TA-TC-FlAsH的單熒光檢

5、測(cè)體系，實(shí)現(xiàn)了對(duì)天然啟動(dòng)子下單細(xì)菌水平毒素蛋白和抗毒素蛋白的分別檢測(cè)。通過(guò)對(duì)不同表達(dá)量TA系統(tǒng)的檢測(cè)，確定了我們的方法能夠靈敏檢測(cè)出毒素蛋白和抗毒素蛋白含量的微小變化，為體系應(yīng)用于應(yīng)激條件下TA系統(tǒng)的含量檢測(cè)提供了可行性驗(yàn)證。通過(guò)在實(shí)驗(yàn)室模擬氨基酸饑餓，異亮氨酸饑餓和熱激等幾種細(xì)菌常見(jiàn)的應(yīng)激環(huán)境，結(jié)合HSFCM，建立了TA系統(tǒng)應(yīng)激模式的TA-TC-FlAsH體系超高靈敏分析方法。對(duì)不同應(yīng)激條件下MqsA蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明抗

6、毒素對(duì)不同的應(yīng)激條件表現(xiàn)不同:氨基酸饑餓會(huì)促使抗毒素蛋白MqsA的降解，異亮氨酸饑餓下抗毒素MqsA的降解是一個(gè)可以恢復(fù)的過(guò)程，對(duì)熱應(yīng)激抗毒素MqsA表現(xiàn)不敏感。
　　論文第三章為實(shí)現(xiàn)對(duì)單細(xì)菌水平毒素蛋白和抗毒素蛋白的同時(shí)檢測(cè)，我們將TC序列和His-tag分別構(gòu)建在毒素和抗毒素序列的末端使其融合表達(dá)，將雙砷染料-四半胱氨酸標(biāo)簽體系與免疫熒光技術(shù)聯(lián)用，結(jié)合HSFCM建立了單細(xì)菌水平天然啟動(dòng)子下毒素蛋白和抗毒素蛋白同時(shí)檢測(cè)的雙熒光超

7、高靈敏分析法。利用雙熒光分析方法對(duì)低拷貝數(shù)的天然啟動(dòng)子指導(dǎo)下的TA系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)帶His-tag和TC-tag的實(shí)驗(yàn)組跟不帶雙標(biāo)簽的陰性對(duì)照組熒光信號(hào)的完全分離;對(duì)不同表達(dá)量的TA系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證了所建立的雙熒光分析方法可以靈敏、準(zhǔn)確地對(duì)單個(gè)細(xì)菌內(nèi)毒素蛋白和抗毒素蛋白的微量變化進(jìn)行雙參數(shù)同時(shí)表征。
　　論文第四章為建立單細(xì)菌水平TA系統(tǒng)調(diào)控模式的超高靈敏分析方法，我們進(jìn)一步引入pBAD30-lon構(gòu)建雙質(zhì)粒體系，通過(guò)誘導(dǎo)Lo

8、n蛋白酶來(lái)調(diào)控TA系統(tǒng)的表達(dá)，利用HSFCM對(duì)細(xì)菌進(jìn)行快速地逐一檢測(cè)分析，探究Lon蛋白酶調(diào)控下單細(xì)菌水平毒素蛋白和抗毒素蛋白相對(duì)含量的變化。結(jié)果表明，與正常生長(zhǎng)條件下細(xì)菌表達(dá)的TA系統(tǒng)相比，Lon蛋白酶誘導(dǎo)表達(dá)的pT5-lac下的實(shí)驗(yàn)組，其抗毒素蛋白MqsA在Lon蛋白酶作用5-8 h的時(shí)候發(fā)生降解，而相應(yīng)的毒素蛋白含量變化不大，單個(gè)細(xì)菌內(nèi)毒素蛋白與抗毒素蛋白的相對(duì)比率上升;Lon蛋白酶誘導(dǎo)表達(dá)的天然啟動(dòng)子下的實(shí)驗(yàn)組，其抗毒素蛋白Mq