單細菌水平毒素抗毒素系統研究新方法.pdf

1、細菌的抗藥性危害日益嚴重，毒素-抗毒素(TA)系統在細菌內的異質性表達是多藥耐受性存留細胞形成的重要原因。闡明致病菌中毒素-抗毒素系統的作用機理和生理功能對研發(fā)防控致病菌的新策略和疾病診斷治療等具有重要意義。目前，對TA系統的研究主要集中在基因水平或轉錄水平，而傳統基于蛋白質水平的檢測方法，如Western Blot等都是對大量細菌裂解液中的毒素抗毒素蛋白進行檢測，是大量細菌內毒素抗毒素蛋白表現的集權平均。對單細菌水平的毒素-抗毒素蛋白

2、進行快速逐一分析可揭示因集權平均而被掩蓋的個體差異，有益于TA系統的異質性考察及亞類表征。
　　本論文旨在將雙砷染料-四半胱氨酸體系與免疫熒光技術聯用，結合實驗室自行研制的超高靈敏流式細胞儀（high sensitivity flow cytometry, HSFCM），通過對單細菌水平毒素和抗毒素的同時檢測，發(fā)展TA系統研究新方法，建立單細菌水平毒素、抗毒素蛋白定量表征技術并考察各參數之間的相互關系;建立TA系統在不同應激條件下

3、的超高靈敏檢測模式，確定TA系統在誘發(fā)細菌程序性阻滯和程序性死亡中的作用;引入雙質粒體系，考察Lon蛋白對TA系統調控的單細菌水平檢測的可行性，為考察TA系統間交互作用并發(fā)展方便、快捷的毒素蛋白誘導因子篩選方法墊定基礎。本研究發(fā)展了單細菌水平、原位、高通量、普適性的TA系統研究新方法，對揭示TA系統的作用機理和研究對抗致病菌及細菌耐藥性的戰(zhàn)略具有重要價值。
　　論文第一章為文獻綜述。重點介紹了毒素抗毒素系統現有的研究方法和單細菌水

4、平研究TA系統的重要性及超高靈敏流式檢測裝置在細菌檢測中的應用。本章的最后介紹了本論文的選題思路和主要研究內容。
　　論文第二章我們以MqsR/MqsA TA系統為研究對象，構建了毒素帶TC標簽和抗毒素帶TC標簽的重組體系。通過對染色方法、染色時間、染料濃度等的優(yōu)化，經HSFCM檢測，天然啟動子下抗毒素及毒素帶TC標簽實驗組與不帶TC標簽的陰性對照組的TC-FlAsH熒光信號可以明顯區(qū)分，成功建立了TA-TC-FlAsH的單熒光檢

5、測體系，實現了對天然啟動子下單細菌水平毒素蛋白和抗毒素蛋白的分別檢測。通過對不同表達量TA系統的檢測，確定了我們的方法能夠靈敏檢測出毒素蛋白和抗毒素蛋白含量的微小變化，為體系應用于應激條件下TA系統的含量檢測提供了可行性驗證。通過在實驗室模擬氨基酸饑餓，異亮氨酸饑餓和熱激等幾種細菌常見的應激環(huán)境，結合HSFCM，建立了TA系統應激模式的TA-TC-FlAsH體系超高靈敏分析方法。對不同應激條件下MqsA蛋白的表達水平進行檢測，結果表明抗

6、毒素對不同的應激條件表現不同:氨基酸饑餓會促使抗毒素蛋白MqsA的降解，異亮氨酸饑餓下抗毒素MqsA的降解是一個可以恢復的過程，對熱應激抗毒素MqsA表現不敏感。
　　論文第三章為實現對單細菌水平毒素蛋白和抗毒素蛋白的同時檢測，我們將TC序列和His-tag分別構建在毒素和抗毒素序列的末端使其融合表達，將雙砷染料-四半胱氨酸標簽體系與免疫熒光技術聯用，結合HSFCM建立了單細菌水平天然啟動子下毒素蛋白和抗毒素蛋白同時檢測的雙熒光超

7、高靈敏分析法。利用雙熒光分析方法對低拷貝數的天然啟動子指導下的TA系統進行檢測，同時帶His-tag和TC-tag的實驗組跟不帶雙標簽的陰性對照組熒光信號的完全分離;對不同表達量的TA系統進行檢測，驗證了所建立的雙熒光分析方法可以靈敏、準確地對單個細菌內毒素蛋白和抗毒素蛋白的微量變化進行雙參數同時表征。
　　論文第四章為建立單細菌水平TA系統調控模式的超高靈敏分析方法，我們進一步引入pBAD30-lon構建雙質粒體系，通過誘導Lo

8、n蛋白酶來調控TA系統的表達，利用HSFCM對細菌進行快速地逐一檢測分析，探究Lon蛋白酶調控下單細菌水平毒素蛋白和抗毒素蛋白相對含量的變化。結果表明，與正常生長條件下細菌表達的TA系統相比，Lon蛋白酶誘導表達的pT5-lac下的實驗組，其抗毒素蛋白MqsA在Lon蛋白酶作用5-8 h的時候發(fā)生降解，而相應的毒素蛋白含量變化不大，單個細菌內毒素蛋白與抗毒素蛋白的相對比率上升;Lon蛋白酶誘導表達的天然啟動子下的實驗組，其抗毒素蛋白Mq