豬鏈球菌2型TypeⅡ毒素-抗毒素系統(tǒng)的鑒定與功能研究.pdf

1、豬鏈球菌（Streptococcus suis）是引起豬鏈球菌病的主要病原體，是上呼吸道的條件致病菌，一旦豬發(fā)病可引起多種疾病，如腦膜炎，敗血癥，關(guān)節(jié)炎，心內(nèi)膜炎，甚至導(dǎo)致死亡，給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。在33個血清型中，豬鏈球菌2型（Streptococcus suis2，S.suis2）被認(rèn)為是養(yǎng)豬行業(yè)中是最流行的，也是毒力最強的病原菌，而且S.suis2還是一種嚴(yán)重的人獸共患病原體，可致人腦膜炎和毒素休克綜合征。毒素抗毒素系

2、統(tǒng)(toxin-antitoxin system，TAS)是細(xì)菌基因組中廣泛存在的一類小型遺傳元件，最初發(fā)現(xiàn)于低拷貝質(zhì)粒上，用于維持質(zhì)粒的穩(wěn)定性，基因組中的TAS改變了細(xì)菌的生理框架，使其提高對外界環(huán)境的適應(yīng)能力，促使細(xì)菌成為優(yōu)勢菌。本課題通過對預(yù)測的7對TypeⅡ TAS進(jìn)行初步的鑒定篩選，探究缺失TAS突變株在毒力方面的影響，取得的主要結(jié)果如下:
　　1.RT-PCR驗證毒素抗毒素基因共轉(zhuǎn)錄
　　提取S.suis2（SC

3、19菌株）的總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，然后以cDNA為模板，用特異性引物進(jìn)行PCR擴增，驗證毒素抗毒素基因共轉(zhuǎn)錄情況，證明毒素抗毒素是由同一操縱子調(diào)控轉(zhuǎn)錄的。
　　2.毒素和抗毒素功能特性的探究
　　構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pBADHisA-toxin(pBADHisA-T)轉(zhuǎn)化至Top10感受態(tài)細(xì)胞，加入阿拉伯糖誘導(dǎo)毒素表達(dá)，繪制生長曲線同時進(jìn)行活菌計數(shù)。結(jié)果表明誘導(dǎo)毒素表達(dá)時，含有pBADHisA-T1，pBADHisA-

4、T5，pBADHisA-T7，pBADHisA-T9的菌株生長受到明顯抑制，誘導(dǎo)毒素表達(dá)2h后，其中含有pBADHisA-T1，pBADHisA-T7，pBADHisA-T9的細(xì)菌生長趨勢已經(jīng)基本不變，而含有pBADHisA-T5的細(xì)菌生長變慢;活菌計數(shù)結(jié)果表明誘導(dǎo)毒素蛋白1(T1)，毒素蛋白7(T7)，毒素蛋白9(T9)表達(dá)，對細(xì)菌有明顯的殺菌作用，但細(xì)菌并沒有被全部殺死，4h后仍然存活的細(xì)菌開始緩慢恢復(fù)生長，而誘導(dǎo)表達(dá)毒素蛋白5(T

5、5)對細(xì)菌沒有明顯的殺菌作用。
　　為進(jìn)一步確定并驗證豬鏈球菌中存在的毒素抗毒素系統(tǒng)，我們將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pET30a-antitoxin，和pBADHisA-toxin一起共轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細(xì)胞，加入IPTG和阿拉伯糖，分別誘導(dǎo)抗毒素和毒素表達(dá)，繪制細(xì)菌的生長曲線，觀察抗毒素能否中和毒素，同時對誘導(dǎo)5h后的細(xì)菌革蘭氏染色，觀察細(xì)菌在誘導(dǎo)毒素抗毒素蛋白表達(dá)情況下的形態(tài)。結(jié)果表明抗毒素蛋白1(A1)，抗毒素蛋白7(A7)，抗

6、毒素蛋白9(A9)能夠中和相應(yīng)的毒素蛋白，使細(xì)菌生長恢復(fù)正常，而只誘導(dǎo)T1，T7，T9表達(dá)的細(xì)菌，生長明顯受到限制，而只誘導(dǎo)T5表達(dá)的細(xì)菌，生長則恢復(fù)到正常水平，說明第5對不是毒素抗毒素系統(tǒng)。革蘭氏染色結(jié)果表明毒素抗毒素的誘導(dǎo)表達(dá)可使E.coli形態(tài)發(fā)生改變，形成明顯的絲狀，可能是細(xì)菌的一種保護(hù)機制。
　　3.毒素抗毒素系統(tǒng)缺失突變株、互補菌株的構(gòu)建及鑒定
　　根據(jù)上述實驗結(jié)果，對第1對，第7對，第9對毒素抗毒素系統(tǒng)構(gòu)建相對

7、應(yīng)的基因缺失突變株。運用溫敏性質(zhì)粒pSET4s構(gòu)建重組質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)化至SC19感受態(tài)細(xì)胞，運用溫度和壯觀霉素抗性篩選得到得到單交換菌株，通過第二次同源重組篩選到基因缺失突變株缺失突變株。運用pSET2構(gòu)建互補質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)化至相應(yīng)的毒素抗毒素系統(tǒng)缺失突變株中，以抗性篩選得到互補菌株，最后通過PCR擴增和DNA測序的方法，證明毒素抗毒素系統(tǒng)缺失突變株和互補菌株構(gòu)建成功。
　　4.毒素抗毒素系統(tǒng)缺失突變株對S.suis2的影響
　　用