不同年齡兔膝關(guān)節(jié)軟骨單位生物學(xué)特性分析.pdf

1、研究背景景：軟骨單位（chondron）作為近年來逐漸重視的關(guān)節(jié)軟骨的基本功能結(jié)構(gòu)，其主要由細(xì)胞周基質(zhì)（pericellular matrix，PCM）與包裹在內(nèi)的一個(gè)或幾個(gè)軟骨細(xì)胞構(gòu)成。由于PCM為介于軟骨細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)（extracellar matrix，ECM）之間的環(huán)形基質(zhì)條帶，理論上成為軟骨細(xì)胞與ECM交通的重要“媒介”，就關(guān)節(jié)軟骨單位特別是PCM在軟骨細(xì)胞代謝及力學(xué)傳導(dǎo)中的作用，逐漸引起人們的重視。包括我們前期的大量研究

2、表明，隨年齡增長及骨關(guān)節(jié)炎時(shí)，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞生物力學(xué)及代謝能力發(fā)生明顯的退變。通過對不同年齡軟骨單位的酶解消化及體外培養(yǎng)組織形態(tài)學(xué)、生物力學(xué)及代謝特點(diǎn)的系統(tǒng)分析，對了解軟骨單位在關(guān)節(jié)軟骨退變機(jī)制中的作用及其作為組織工程軟骨種子細(xì)胞的生物學(xué)優(yōu)勢具有積極的意義。
　　 研究目的的：①與軟骨細(xì)胞比較，系統(tǒng)分析幼、中、老不同年齡軟骨單位體外酶解消化組織形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，建立和完善軟骨單位體外酶解消化實(shí)驗(yàn)方法；②與軟骨細(xì)胞比較，分析幼、中、老不同

3、年齡軟骨單位生物力學(xué)變化特點(diǎn)，探討軟骨單位在關(guān)節(jié)軟骨退變力學(xué)機(jī)制中的作用；③與軟骨細(xì)胞比較，分析軟骨單位體外培養(yǎng)過程中組織形態(tài)學(xué)、增殖及基質(zhì)合成代謝水平的變化特點(diǎn)，完善軟骨單位體外生物學(xué)特性分析。
　　 研究內(nèi)容容：本課題進(jìn)行了以下三項(xiàng)相關(guān)研究。①不同年齡兔膝關(guān)節(jié)軟骨單位體外酶解消化組織形態(tài)學(xué)分析：取新西蘭白兔30只，按年齡分為3組：幼年組（2月齡）、中年組（8月齡）及老年組（31月齡），各10只。每組5只兔子10膝進(jìn)行原位組織

4、切片形態(tài)學(xué)觀察，包括HE、甲苯胺藍(lán)及Ⅱ、Ⅵ型膠原免疫熒光染色觀察分析；采用reAltime-PCR的方法分析不同年齡軟骨細(xì)胞糖胺多糖（glycosaminoglycans，GAG）和Ⅱ型膠原(collagen-typeⅡ，Col-2)mRNA的表達(dá)。同時(shí)，采用0.3％ dispase酶和0.2％ II型膠原酶聯(lián)合攪拌消化3h的方法獲取不同年齡兔膝關(guān)節(jié)軟骨單位，采用HE、Ⅵ型膠原免疫熒光染色等方法觀察分析不同年齡軟骨單位體外組織形態(tài)學(xué)特點(diǎn)

5、。②不同年齡兔膝關(guān)節(jié)軟骨單位體外微管吸吮黏彈性力學(xué)分析：按第一部分的酶解實(shí)驗(yàn)方法，分別獲取幼、中、老不同年齡兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞和軟骨單位。利用微管吸吮結(jié)合半無限體細(xì)胞力學(xué)模型定量分析急性消化不同年齡軟骨細(xì)胞及軟骨單位黏彈性力學(xué)特性，包括平衡模量E6、瞬間模量E0和表觀黏性μ等黏彈性參數(shù)。同時(shí)，利用激光共聚焦顯微鏡觀察、reAltime-PCR及western-blotting等技術(shù)方法分析不同年齡軟骨細(xì)胞細(xì)胞骨架分布和含量的變化特點(diǎn)。③兔

6、膝關(guān)節(jié)軟骨單位體外培養(yǎng)生物學(xué)特性分析：在前期研究的基礎(chǔ)上，酶解消化分別獲取幼年（2月齡）新西蘭兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞和軟骨單位，均進(jìn)行體外貼壁單層培養(yǎng)1、3、6、9天，通過HE、Ⅵ型膠原免疫熒光染色觀察分析軟骨細(xì)胞及軟骨單位的形態(tài)學(xué)變化；通過MTT法檢測軟骨細(xì)胞與軟骨單位的增殖情況；通過reAltime-PCR的技術(shù)分析軟骨細(xì)胞及軟骨單位體外培養(yǎng)過程中GAG、Col-2、基質(zhì)金屬蛋白酶-3(matrix metalloproteinase，M

7、MP-3)及基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)mRNA表達(dá)。收集上清液通過Elisa技術(shù)分析軟骨細(xì)胞及單位不同時(shí)間GAG、Col-2、MMP-3及TIMP-1的上清液分泌含量。
　　 研究結(jié)果及結(jié)論論：①隨年齡增長關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)和形態(tài)發(fā)生退行性變化的同時(shí)，膝關(guān)節(jié)軟骨單位原位組織形態(tài)學(xué)發(fā)生明顯的變化。其中，軟骨細(xì)胞周圍PCM界限隨年齡增長逐漸

8、清楚，軟骨深層內(nèi)出現(xiàn)大量由PCM基質(zhì)包裹縱向排列2～4個(gè)軟骨細(xì)胞的軟骨單位形態(tài)。與單純軟骨細(xì)胞相比，體外酶解消化軟骨單位PCM成分明顯、完整，且較好保留了不同年齡關(guān)節(jié)軟骨單位原位組織形態(tài)學(xué)的特點(diǎn)。②不同年齡關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞均表現(xiàn)出典型的黏彈性固體蠕變特征，但隨年齡增長，其黏彈力學(xué)特性逐漸下降；同時(shí)，隨年齡增長，細(xì)胞骨架排列結(jié)構(gòu)及含量發(fā)生明顯變化，提示其在軟骨細(xì)胞力學(xué)維持方面的作用。軟骨單位作為一個(gè)整體單元結(jié)構(gòu)，可實(shí)現(xiàn)體外微管吸吮黏彈性分析，

9、表現(xiàn)為黏彈性固體特性，但其力學(xué)特性較單純軟骨細(xì)胞明顯提高，提示PCM在軟骨細(xì)胞力學(xué)微環(huán)境維持中作用；隨年齡增長，軟骨單位黏彈性逐漸增高，提示軟骨單位在關(guān)節(jié)軟骨發(fā)育成熟與退變力學(xué)機(jī)制中的作用。③軟骨單位體外貼壁單層培養(yǎng)過程中，早期由于PCM的存在，軟骨單位增殖較慢；后期PCM基質(zhì)逐漸降解消化后，軟骨單位開始像軟骨細(xì)胞一樣快速分裂增殖，提示軟骨單位體外培養(yǎng)保留了軟骨細(xì)胞較好的增殖潛力。在體外貼壁單層培養(yǎng)過程中，軟骨單位GAG、Col-2等基