內皮祖細胞生嚴重創(chuàng)傷性腦損傷患者外周血中表達及預后的意義.pdf

1、背景：EPCs(endothelial progenitor cells)來源于胚胎的中胚層和出生后的骨髓，不僅參與胚胎血管生成，而且近年研究發(fā)現，EPC也參與出生后的血管新生過程，是一群被發(fā)現存在于胎肝、臍帶血和成人外周循環(huán)血中的、能夠分化為內皮細胞的多潛能細胞，這群細胞不但具有修復損傷內皮細胞的功能而且還能增強組織缺血后的血管發(fā)生(vasculogenesis)和血管新生(angiogenesis)，提示在缺血性疾病、防止血管再狹窄

2、、血管創(chuàng)傷愈合等過程中具有重要的治療作用。最近的研究顯示：EPCs可促進顱腦創(chuàng)傷大鼠損傷區(qū)腦組織的血管、神經新生以及神經功能恢復，這為下一步的臨床應用奠定了基礎。
　　 目的：
　　 1.研究創(chuàng)傷性腦損傷患者外周血來源內皮祖細胞的分離、培養(yǎng)、增殖及鑒定。
　　 2.探討循環(huán)內皮祖細胞對創(chuàng)傷性腦損傷患者血管損傷修復的可能機制。
　　 3.探討顱腦損傷對循環(huán)內皮祖細胞的動員及預后判斷的意義。
　　 方

3、法：
　　 1.應用密度梯度離心法分離創(chuàng)傷性腦損傷患者外周血單個核細胞，應用EGM培養(yǎng)基，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)3天換液去除未貼壁細胞，以后每3天換液一次，倒置相差熒光顯微鏡下動態(tài)觀察培養(yǎng)細胞的形態(tài)變化特征。通過硫氰酸熒光素標記的乙酰化低密度脂蛋白(DiI-ac-LDL)攝取試驗和荊豆凝集素(FITC-UEA-1)結合實驗，進行內皮祖細胞的功能鑒定。體外培養(yǎng)至第7天，采用流式細胞儀檢測CD34，CD133雙熒光

4、標記陽性細胞所占比率。
　　 2.連續(xù)收集2009年1月至2010年4月天津醫(yī)科大學總醫(yī)院神經外科治療的重型創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)而無肢體損傷患者外周血及血清標本。創(chuàng)傷性顱腦損傷患者損傷程度由Glasgow Coma Scale(GCS)評分決定。同期收集18-60歲健康志愿者外周血及血清標本。嚴重創(chuàng)傷性腦損傷患者及對照組外周血內皮祖細胞數量分別在腦損傷后的1天、4天、7天、14天及21天用流式細胞儀進行檢測。在相同時間點對上述

5、兩組血清的血管生成素(Ang-1)及血管內皮生長因子(VEGF)進行ELISA檢測。
　　 3.收集嚴重創(chuàng)傷性腦損傷患者21例及20例正常對照組的外周血及血清標本。分別于創(chuàng)傷性腦損傷后的1天、4天、7天、14天及21天用流式細胞儀檢測外周血內皮祖細胞的數量及用ELISA檢測血清基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)及血管內皮生長因子(VEGF)變化。并對創(chuàng)傷性腦損傷患者傷后6個月的glasgow outcome scale(GOS)評

6、分進行前瞻性的分析。
　　 結果：
　　 1.培養(yǎng)3天換液去除未貼壁細胞后，可見少數細胞呈集落式生長，細胞形態(tài)多為短梭型或多角形。培養(yǎng)7天，梭型細胞較前增多，形成細胞團。14天可見到細胞形成索狀或網狀血管樣結構。倒置相差熒光顯微鏡下觀察顯示胞質和胞膜呈綠色和紅色雙熒光，說明內皮祖細胞能特異性吸附DiI-acLDL和結合FITC-UEA-1，具有內皮細胞功能。流式細胞儀鑒定EPC細胞表型CD34和CD133雙陽性的細胞為1

7、8.57％。
　　 2.與對照組相比，循環(huán)內皮祖細胞在嚴重創(chuàng)傷性腦損傷后第4天降低，第7天達到最高。血管內皮生長因子水平始終高于對照組水平。血管生成素1在第14天到達最高峰。循環(huán)內皮祖細胞與嚴重腦創(chuàng)傷后7天、14天的Ang-1和VEGF血清水平明顯相關。
　　 3.與對照組相比，循環(huán)內皮祖細胞的變化與前期研究一致。顱腦創(chuàng)傷后第7天達到高峰，并且與患者傷后6個月的GOS評分明顯相關。MMP-9和VEGF水平傷后始終高于對照

8、組。循環(huán)內皮祖細胞與創(chuàng)傷性腦損傷后1天的GCS評分相關，與創(chuàng)傷性腦損傷后7天、14天的MMP-9和VEGF水平相關。
　　 結論：
　　 1.創(chuàng)傷性腦損傷患者外周血來源的單個核細胞在體外應用EGM培養(yǎng)基培養(yǎng)，可以分化為內皮祖細胞，為內皮祖細胞研究奠定了基礎。
　　 2.血管生成素-1(Angiopoietin-1)和血管內皮生長因子(VEGF)是調節(jié)血管生成反應和維持血管完整性的兩個關鍵性蛋白，在患者腦創(chuàng)傷后14

9、天達到峰值，并且在腦創(chuàng)傷后7天、14天分別與內皮祖細胞相關，這些結果提示嚴重創(chuàng)傷性腦損傷后血管內皮生長因子、血管生成素-1及循環(huán)內皮祖細胞有可能參與到了血管修復的病理生理過程中。
　　 3.我們的研究結果顯示創(chuàng)傷性腦損傷后循環(huán)內皮祖細胞升高，MMP-9和VEGF可能參與調節(jié)嚴重創(chuàng)傷性腦損傷后內皮祖細胞由骨髓動員至外周血的過程當中。我們的研究結果還顯示循環(huán)內皮祖細胞與患者的神經功能恢復相關聯，這些證據提示循環(huán)內皮祖細胞是判斷血管新