人參皂苷Rg1延緩神經(jīng)干細(xì)胞衰老作用及機(jī)理研究.pdf

1、干細(xì)胞衰老學(xué)說是迄今解釋機(jī)體衰老機(jī)制的最新學(xué)說。隨著對干細(xì)胞研究的深入，人們認(rèn)識到干細(xì)胞并非是“長生不老”的細(xì)胞，所有衰老現(xiàn)象都反映出成體干細(xì)胞衰老的水平。研究證明，隨著年齡的增長，人或動物大腦內(nèi)的神經(jīng)發(fā)生率呈指數(shù)下降，其原因可能與神經(jīng)干細(xì)胞(Neural stem cells，NSCs)衰老導(dǎo)致的自我更新和多向分化能力衰退有關(guān)。因此，深入研究NSCs衰老和延緩NSCs衰老的現(xiàn)代生物學(xué)機(jī)理，尋找重新激活NSCs的方法和調(diào)控它靶向分化對預(yù)

2、防和治療老年退行性疾病有不可估量的社會價值。
　　 人參作為中醫(yī)臨床“補(bǔ)氣”要藥已有2000多年的應(yīng)用歷史，現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，人參皂苷是人參的主要藥效成分，具有廣泛的藥理作用，人參皂苷Rg1是重要的人參單體皂苷。近年研究認(rèn)為，人參皂苷Rg1對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有明確的調(diào)節(jié)作用，具促智和益智功效。也有學(xué)者的工作證明，人參皂苷Rg1能夠提高體內(nèi)外神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖能力，但其作用機(jī)制尚不清楚。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1能延緩造血干細(xì)

3、胞衰老，其機(jī)制與調(diào)控p16INK4a-Rb、p19Arf-p53-p21Cipl/Wafl信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及延緩端粒長度縮短、提高端粒酶活性有關(guān)。迄今還未見關(guān)于人參皂苷Rg1對體、內(nèi)外NSCs衰老相關(guān)生物學(xué)特征的影響及機(jī)制報道。本課題將干細(xì)胞最新的研究技術(shù)與祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的抗衰老理論和對干細(xì)胞的認(rèn)識緊密結(jié)合起來，摸索復(fù)制NSCs體外衰老模型方法及復(fù)制D-半乳糖腦衰老動物模型，并在此基礎(chǔ)上從體內(nèi)和體外兩條途徑系統(tǒng)探討人參皂苷單體Rg1延緩NS

4、Cs衰老的作用及其可能的生物學(xué)調(diào)控機(jī)制。旨在為探尋延緩NSCs衰老以及重新激活衰老NSCs的途徑提供理論及實驗依據(jù)。
　　 材料和方法
　　 1.從新生SD大鼠海馬組織內(nèi)分離提取細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，并通過以下檢測鑒定培養(yǎng)細(xì)胞是NSCs：
　　 1)NSCs標(biāo)志物--Nestin免疫細(xì)胞化學(xué)染色；
　　 2)根據(jù)NSCs多向分化特性，誘導(dǎo)培養(yǎng)的NSCs分化并進(jìn)行神經(jīng)元特異性核蛋白NeuN、星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物G

5、FAP、少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Gal-C免疫細(xì)胞化學(xué)檢測；
　　 3)根據(jù)NSCs自我更新特性，進(jìn)行BrdU摻入實驗和BrdU免疫細(xì)胞化學(xué)染色。
　　 2.采用不同濃度的D-gal(4、8、10、12、16 mg/mL)分別作用第3代NSCs24、48、72 h或t-BHP(50、100、150μmol/L)分別作用第3代NSCs1 h、2 h、3 h進(jìn)行如下檢測：
　　 1)MTT檢測各組NSCs的增殖能力；

6、>　　 2)每毫升培養(yǎng)體系接種3000個NSCs，計數(shù)NSCs增殖形成的NSCs克隆球數(shù)量；
　　 3)體外誘導(dǎo)分化培養(yǎng)檢測NSCs多向分化能力，采用體視學(xué)方法對分化形成的神經(jīng)元樣細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)估計其數(shù)密度(單位面積內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量)；
　　 4)衰老特異性β-半乳糖苷酶染色顯示衰老神經(jīng)球，采用體視學(xué)方法計數(shù)陽性及陰性神經(jīng)球的數(shù)量，以陽性神經(jīng)球的數(shù)量除以兩者之和即為SA-β-Gal陽性神經(jīng)球百分比。
　　 通過以上檢

7、測選擇誘導(dǎo)NSCs衰老的最佳體外模型。
　　 3.將第3代NSCs分為對照組、衰老組(100μmol/L t-BHP作用2 h)、Rg1組(10μg/ml Rg1作用2 h)，Rg1抗衰老組(100μmol/L t-BHP和10μg/ml Rg1共同作用2 h)和Rg1治療衰老組(按衰老組處理后，再用10μg/ml Rg1作用2 h)，通過以下檢測探討人參皂苷Rg1延緩NSCs衰老的體外作用及機(jī)制：
　　 1)同方法21

8、)-3)檢測指標(biāo)；
　　 2)體外誘導(dǎo)分化培養(yǎng)檢測NSCs多向分化能力，采用體視學(xué)方法對分化形成的神經(jīng)元樣細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞分別進(jìn)行計數(shù)并分別估計這三種細(xì)胞的數(shù)密度；
　　 3)檢測各組NSCs衰老相關(guān)基因p16INK4a、p21Cipl/WaflmRNA的表達(dá)水平。
　　 4.將30只3月齡雄性SD大鼠隨機(jī)分組。腦衰老組：大鼠頸背部皮下連續(xù)注射D-半乳糖42d(120 mg.kg-1/

9、d)；Rg1抗腦衰老組：同衰老模型組處理，并從模型復(fù)制的第15 d起腹腔注射Rg1(20 mg.kg-1/d)，連續(xù)注射28 d；對照組：正常大鼠頸背部皮下連續(xù)注射等時和等量生理鹽水。各組大鼠在處死前1 d每4 h腹腔注射BrdU50 mg.kg-1/次，共注射3次。并進(jìn)行以下幾方面檢測：
　　 1)Morris水迷宮評估各組大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力；
　　 2)比色法測定腦皮質(zhì)內(nèi)的SOD活性及MDA含量；
　　

10、3)實時熒光定量RT-PCR檢測海馬組織內(nèi)p16INK4a、p21Cipl/WaflmRNA的表達(dá)水平；
　　 4)Western blotting檢測衰老相關(guān)基因P16INK4a、P21Cipl/Wafl蛋白的表達(dá)水平；
　　 5)各組動物制作海馬及SVZ區(qū)的腦組織石蠟切片，分別用NeuN、BrdU免疫組織化學(xué)顯色顯示神經(jīng)元細(xì)胞核和腦組織內(nèi)的增殖細(xì)胞，鏡下觀察各組動物海馬及SVZ區(qū)形態(tài)學(xué)特征，采用體視學(xué)新技術(shù)--光學(xué)體

11、視框估計SVZ區(qū)BrdU陽性細(xì)胞的數(shù)密度(單位體積SVZ區(qū)內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量)。
　　 結(jié)果：
　　 1.體外培養(yǎng)的NSCs呈Nestin免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽性反應(yīng)；誘導(dǎo)分化形成的細(xì)胞呈NeuN(顯示神經(jīng)元)、GFAP(顯示星形膠質(zhì)細(xì)胞)和Gal-C(顯示少突膠質(zhì)細(xì)胞)免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽性反應(yīng)；BrdU摻入實驗呈BrdU免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽性反應(yīng)。
　　 2.不同濃度的D-gal或t-BHP作用于體外培養(yǎng)的NSCs，均可引

12、起NSCs的增殖能力、NSCs克隆球形成率和分化形成的神經(jīng)元數(shù)密度顯著下降，β-半乳糖苷酶染色陽性神經(jīng)球比率顯著升高。
　　 3.與衰老組(t-BHP100μmol/L作用NSCs2 h)比較，抗衰老組(10μg/ml Rg1作用NSCs2 h)及治療衰老組(100μmol/L t-BHP作用2 h，再用10μg/ml Rg1作用NSCs2 h)的NSCs MTT吸光度值分別升高了35％和78％；NSCs克隆球形成數(shù)分別顯著增加

13、了29％和35％；衰老特異性SA-β-Gal染色陽性神經(jīng)球百分比顯著降低了40％和58％；衰老相關(guān)基因p16INK4a、p21Cipl/WaflmRNA表達(dá)水平顯著下降。與衰老組比較，Rg1抗衰老組的神經(jīng)元樣細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的數(shù)密度顯著增加，分別是衰老組的2.2倍、1.9倍和1.7倍；Rg1治療衰老組的三種細(xì)胞的數(shù)密度顯著增加，分別是衰老組的2.7倍、6.3倍和2.7倍。
　　 4.與D-半乳糖腦衰老

14、組相比，Rg1抗腦衰老組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力顯著提高；腦組織內(nèi)SOD活性顯著升高，MDA含量顯著降低；p16INK4a、p21 Cipl/Wafl mRNA及蛋白的表達(dá)水平顯著降低；NeuN免疫組織化學(xué)切片顯示齒狀回區(qū)神經(jīng)元大小較一致，排列較緊密，細(xì)胞核著色較均勻、輪廓較清楚；SVZ區(qū)BrdU圓形和橢圓形陽性細(xì)胞的數(shù)量顯著增加到腦衰老組的10.4倍和10.8倍。
　　 結(jié)論：
　　 1.本研究體外培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)鑒定為NSCs。

15、
　　 2.D-半乳糖或t-BHP均能在體外誘導(dǎo)NSCs衰老，以D-gal10 mg/ml作用48 h和t-BHP100μmol/L作用2 h為衰老模型的較好選擇。
　　 3.人參皂苷Rg1可以增強(qiáng)已經(jīng)衰老NSCs的增殖和分化能力，減少NSCs溶酶體的數(shù)量，提示其具有抗衰老和治療衰老的作用，其機(jī)制可能與下調(diào)衰老相關(guān)基因p16INK4a、p21Cipl/Wafl mRNA的表達(dá)有關(guān)。
　　 4.Rg1具有延緩D-半