人參皂苷Rg1對體外培養(yǎng)人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞衰老的影響.pdf

1、目的:建立D-半乳糖誘導(dǎo)人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞(hUCB-MSCs)衰老的模型，同時探討人參皂苷Rg1(Rg1)預(yù)防hUCB-MSCs衰老的作用和可能的作用機(jī)制。方法:密度梯度離心分離臍帶血單個核細(xì)胞，獲取純化的第5代細(xì)胞，衰老組采用終濃度D-半乳糖8g/L培養(yǎng)基至第7代誘導(dǎo)衰老，同量D-半乳糖處理48 h誘導(dǎo)輕微衰老后，應(yīng)用Rg10.01～3μmol/L抗衰老治療72 h。衰老預(yù)防組分別應(yīng)用D-半乳糖8g/L加Rg10.01～3μmol/

2、L作用72 h。倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面分子與細(xì)胞周期，細(xì)胞免疫化學(xué)染色鑒定胞漿內(nèi)蛋白表達(dá)情況，顯微鏡下測定細(xì)胞表面積和表達(dá)β-半乳糖苷酶細(xì)胞百分率，MTT法檢測光密度值，繪制生長曲線，誘導(dǎo)培養(yǎng)后特色染色鑒定成脂與成骨細(xì)胞real time-PCR檢測衰老相關(guān)調(diào)控基因與成脂、成骨相關(guān)基因表達(dá)。結(jié)果:①對照組、模型組以及Rg10.1μmol/L組均穩(wěn)定表達(dá)CD44、CD105、CD90、CD73和胞漿

3、的波形蛋白，不表達(dá)CD45、CD34、CD11b、CD19和HLA-DR。②與對照組相比，模型組hUCB-MSCs呈多角形，胞體變大;細(xì)胞表面積也明顯增大(P＜0.05);生長曲線明顯壓低，細(xì)胞倍增時間112 h，而對照組為54.43 h。模型組β-gal染色陽性細(xì)胞百分率明顯高于對照組(P＜0.05); hUCB-MSCs細(xì)胞周期明顯阻滯于G0/G1期，G0/G1期細(xì)胞比例較高，增殖指數(shù)明顯較低(P＜0.05)。③抗衰老治療中，與模型

4、組相比，MTT測定存活細(xì)胞OD值，Rg10.1μmol/L和3μmol/L對衰老的hUCB-MSCs增殖無明顯影響(P＞0.05)。④誘導(dǎo)hUCB-MSCs輕微衰老，與模型組相比，Rg10.1μmol/L和3μmol/L治療組hUCB-MSCs MTT測定的吸光度值均明顯升高(P＜0.05)。⑤衰老預(yù)防處理后，與模型組相比，Rg10.1μmol/L和3μmol/L(P＜0.05或P＜0.01)治療組hUCB-MSCs MTT測定的OD均

5、明顯升高。模型組細(xì)胞較寬大扁平，細(xì)胞表面積比對照組和Rg10.1μmol/L治療組均增大(P＜0.05)，Rg10.1μmol/L治療組次之;β-gal染色陽性細(xì)胞百分率也呈現(xiàn)相似的排序結(jié)果;模型組hUCB-MSCs倍增時間77.83 h，Rg10.1組為65.21h;流式周期分析各組未見明顯差異。對照組、Rg10.1組以及模型組hUCB-MSCs，均可誘導(dǎo)出成骨、成脂細(xì)胞。成骨誘導(dǎo)可見，對照組hUCB-MSCs形成茜素紅染色陽性骨結(jié)節(jié)

6、的面積要遠(yuǎn)大于模型組，Rg10.1組次之，模型組最低;Rg10.1組成脂誘導(dǎo)油紅染色陽性脂滴數(shù)量似低于模型組。⑥定量PCR結(jié)果顯示，衰老預(yù)防處理后，與對照組相比，模型組P16、TBX2、ALDH1A3、CALR表達(dá)均具明顯差異(P＜0.01)，而P53和P21 mRNA表達(dá)無顯著改變;與模型組相比，Rg10.1組P16、TBX2 mRNA表達(dá)量具顯著差異(P＜0.01)。hUCB-MSCs誘導(dǎo)向成骨與成脂細(xì)胞分化后，與對照組比較，誘導(dǎo)組

7、RUNX2、ALP、OCN和PPARG、LPLmRNA表達(dá)均顯著升高;與誘導(dǎo)組比較，模型組RUNX2、ALP、OCN明顯降低，而PPARG、LPL mRNA表達(dá)則明顯增高;與模型組比較，Rg10.1組RUNX2、LPL mRNA表達(dá)具顯著差異(P＜0.05)，與誘導(dǎo)組比較無顯著差異（P＞0.05）;而ALP、OCN和PPARG mRNA表達(dá)與模型組之間比較無顯著差異。結(jié)論:采用D-半乳糖8g/L培養(yǎng)兩代，可成功誘導(dǎo)hUCB-MSCs衰老