晚期氧化蛋白產(chǎn)物單克隆抗體的制備和初步應(yīng)用.pdf

1、晚期氧化蛋白產(chǎn)物(Advanced oxidation protein products,AOPP)是體內(nèi)氧化應(yīng)激過程中生成的一類含雙酪氨酸的蛋白質(zhì)交聯(lián)物,血漿AOPP以次氯酸(HOCl)氧化修飾的白蛋白為主。循環(huán)AOPP水平增高最先在慢性腎功能衰竭、腹膜透析的患者中被發(fā)現(xiàn),隨后在糖尿病、肥胖或代謝綜合征、動脈粥樣硬化等多種常見疾病中被證實(shí)。AOPP增高還見于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、潰瘍性結(jié)腸炎等免疫炎癥性疾病和惡性腫瘤(結(jié)腸、直腸癌、乳腺癌等

2、),因此AOPP被認(rèn)為是體內(nèi)氧化應(yīng)激的敏感生物學(xué)標(biāo)志。
　　 近年不斷增加的研究證據(jù)表明,血漿AOPP水平增高促使該分子在腎臟和血管等組織中沉積并與慢性腎臟病(chronic kidney disease,CKD)及動脈粥樣硬化病變的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。慢性AOPP在體內(nèi)堆積促進(jìn)糖尿病動物模型的腎臟的炎癥反應(yīng)和腎組織損傷,促使CKD動物模型的腎臟炎癥和纖維化,并促使高脂血癥動物發(fā)生動脈粥樣硬化性病變。這些研究結(jié)果均表明,AOPP潴

3、留不僅是反映體內(nèi)氧化應(yīng)激的指標(biāo),其本身可能是一類促進(jìn)組織炎癥和纖維化的生物致病分子。深入探討AOPP在組織中的分布及其與病變的關(guān)系對于闡明AOPP致病的分子基礎(chǔ)至關(guān)重要,并有可能為上述疾病的發(fā)生發(fā)展提供新的生物學(xué)標(biāo)志或干預(yù)靶標(biāo)。
　　 然而,目前檢測組織中AOPP水平尚缺乏理想方法。檢查外周血AOPP則通常采用比色分析法以340nm處吸光度值以反映標(biāo)本中AOPP水平,這是基于AOPP結(jié)構(gòu)含雙酪氨酸,在酸性條件下于340nm處有一

4、特異吸收峰。此法雖然簡便,但易受血脂、纖維蛋白的干擾而影響其準(zhǔn)確性；且不能用于對病變組織或細(xì)胞中的AOPP定位。
　　 我們擬建立免疫學(xué)檢查方法克服上述缺點(diǎn)。采用體外次氯酸修飾的白蛋白作為抗原,成功制備了特異性識別AOPP的單克隆抗體,通過Western Blot、免疫組織化學(xué)染色首次證實(shí)單抗識別血清和沉積于腎臟中的AOPP,初步建立雙單抗、單多抗及多單抗夾心ELISA法鑒定人工制備的AOPP,為深入研究AOPP這種內(nèi)源性致病分

5、子提供了必要工具。此外,我們利用噬菌體肽庫篩選技術(shù)對AOPP模擬表位進(jìn)行了初步探討。
　　 第一章:特異性識別天然AOPP單克隆抗體制備和鑒定
　　 以次氯酸(HOCl)氧化不同種屬血白蛋白(包括人血清白蛋白HSA、小鼠血清白蛋白MSA、牛血清白蛋白BSA、兔血清白蛋白RSA)和人纖維蛋白原、人IgG、人低密度脂蛋白(LDL),按蛋白:HOCl摩爾比為1:140等體積混合,室溫放置30分鐘。制備的AOPP在PBS中透析2

6、4小時,除去游離的HOCl。AOPP含量通過測定酸性條件下340nm的吸光度,以氯胺T為標(biāo)準(zhǔn)測得。用AOPP-MSA為免疫原加佐劑免疫BALB/c小鼠,取小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞(NS-1)融合,按常規(guī)方法制備雜交瘤。以AOPP-HSA為抗原包被酶標(biāo)板,并以未氧化正常HAS做平行篩選以排除與正常蛋白的交叉反應(yīng)。間接ELISA鑒定篩選特異性識別AOPP-HSA的雜交瘤克隆,所獲兩株命名為3F2和4C5；擴(kuò)大培養(yǎng)后制備腹水,用辛酸硫酸銨沉淀法

7、、Hltrap Protein G親和層析柱從腹水中純化抗體?？贵w類別鑒定顯示3F2為IgG1,4C5為IgG2a。
　　 間接ELISA結(jié)果顯示2株單抗均能與不同種屬來源的氧化型白蛋白(AOPP-HSA、AOPP-BSA、AOPP-MSA、AOPP-RSA)、HOCl-人纖維蛋白原、HOCl-人IgG、HOCl-LDL特異性結(jié)合,而與未氧化蛋白及Cu2+氧化的LDL、糖基化蛋白均無交叉反應(yīng)。競爭ELISA鑒定表明這兩株單抗分別

8、識別AOPP不同位點(diǎn)。Western Blot結(jié)果顯示,在變性與非變性條件下,3F2可特異性結(jié)合人工制備的AOPP-HSA、HOCl-IgG、HOCl-人纖維蛋白原。
　　 單抗3F2亦可識別天然血漿與組織中的AOPP。能在一定程度上區(qū)分血液透析患者和正常人血漿中AOPP含量的差別以及慢性腎衰患者透析前后血漿AOPP含量的不同。免疫組織化學(xué)法檢查顯示3F2可特異性結(jié)合沉積于大鼠模型及各種慢性腎臟病患者腎組織中的AOPP,這種結(jié)合

9、可被外源AOPP阻斷。此外,3F2可阻斷AOPP誘導(dǎo)小鼠單核細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞胞內(nèi)氧化反應(yīng)簇(ROS)生成。
　　 第二章:建立雙抗體夾心ELISA檢測血漿AOPP的嘗試
　　 以Hltrap Protein G柱純化抗體3F2和4C5,純度達(dá)95％以上并按照操作流程標(biāo)記生物素。分別以雙單抗、多單抗夾心、單多抗夾心ELISA方法檢測人工制備的AOPP并進(jìn)行了體系的優(yōu)化。在抗體包被濃度為1μg/ml,封閉液為0.2

10、5％酪蛋白,洗液與抗體稀釋液均為0.5％PBST,檢測抗體濃度為0.5μg/ml時即可良好檢測標(biāo)準(zhǔn)品。之后,我們又試用了競爭ELISA的方法,以人工制備的AOPP—HSA1.25μg/ml包被酶標(biāo)板,倍比稀釋AOPP-HSA(0-4μg/ml)、慢性腎衰患者、健康成人血清與0.5μg/ml Bio-3F2等體積混勻后加入板孔中,最后加入HRP-親和素。標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合度良好,而且各種抗體組合的雙夾心ELISA均可特應(yīng)性地檢出人工體外制備的

11、AOPP,且敏感度可達(dá)ng/ml水平但是腎衰患者與正常人的測定值之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此又嘗試用敏感性更強(qiáng)的時間分辨熒光檢測法檢測患者血清AOPP,按照普通夾心ELISA的條件摸索,即以4C51μg/ml包被酶標(biāo)板,酪蛋白封閉后,加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品AOPP-HSA,反應(yīng)30min后加入Bio-3F20.5μg/ml,30min后加入銪標(biāo)記的親和素,15min后加入增強(qiáng)液,37℃反應(yīng)5min后多功能酶標(biāo)儀測值。所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線已經(jīng)符合臨

12、床檢測的需要,但是在血清樣本的檢測上面,還是存在一定的問題,最佳的包被與檢測條件還要改變。
　　 第三章:AOPP表位模擬序列的篩選
　　 鑒于已確定的自然和人工制備的AOPP均為在體內(nèi)外次氯酸氧化的白蛋白、脂蛋白或其他蛋白,即已形成非天然抗原表位。本章工作的目的旨在探索體內(nèi)是否有自然存在的類似于AOPP表位的序列,如果存在,將會對機(jī)體產(chǎn)生何種影響。
　　 我們以親和層析純化的抗AOPP多克隆抗體為靶標(biāo),對噬菌體

13、隨機(jī)十二肽庫進(jìn)行了三輪篩選后,鑒定出18個陽性克隆,均可與多抗產(chǎn)生較強(qiáng)的結(jié)合,且不為吸板克隆。挑選6個陽性克隆經(jīng)DNA測序得到三條序列:GWLEENLFDHTR、SSALNDMLRDQR、DSLQDMLADEWQ。上述序列中具有近似的LXDMLXD(X為任意氨基酸)核心序列,提示這一核心序列有可能是模擬AOPP共同表位的優(yōu)勢序列。其次又以抗AOPP單克隆抗體3F2為靶標(biāo),篩選噬菌體十二肽庫,經(jīng)三輪篩選、ELISA鑒定獲得18個與3F2特

14、異結(jié)合的噬菌體克隆,但這些陽性克隆與抗AOPP多抗和4C5單抗無交叉反應(yīng)。DNA測序得到 SSYSQDAATLRL、LNTPYRNQLAYP、LPYFDSYDSALP、AHPMPMTQLFTS四條序列中未發(fā)現(xiàn)保守序列。最后,在以單抗4C5為靶分子篩選噬菌體十二肽庫,經(jīng)ELISA鑒定得到的12個克隆與4C5特異結(jié)合,其中一個克隆(No.2)與多抗及單抗3F2較強(qiáng)結(jié)合。DNA測序得到的三種序列,LSPLPHPLTRTV、QNLPEWLALH

15、LD、RASPDLLEHQLM,但未發(fā)現(xiàn)保守序列。采用NCBI數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)的Blastp程序在蛋白質(zhì)水平上對篩選的所有序列分別進(jìn)行同源性搜索,其結(jié)果顯示這些序列存在于某些真菌屬、藻類的蛋白分子上,而并不存在于正常的人類與哺乳動物蛋白分子中。即模擬AOPP抗原表位的序列并不存在于已知的正常人與哺乳動物蛋白分子中,其意義在于避免了與AOPP表位相似而導(dǎo)致的后續(xù)事件,維持了機(jī)體內(nèi)