SIV p27單克隆抗體的制備、性質(zhì)分析和初步應(yīng)用.pdf

1、猴免疫缺陷病毒(SimianImmunodeficiencyVirus，SIV)在基因組成、形態(tài)、理化特性、分子生物學(xué)特性和致病機(jī)制等方面與HIV非常相似，因此以SIV或SHIV(SIV與HIV-1構(gòu)成的一種嵌合病毒)感染動(dòng)物，建立的靈長(zhǎng)類(lèi)模型成為目前AIDS研究中最常用的動(dòng)物模型。在模型的建立和使用中，血液SIV抗原檢測(cè)對(duì)于病毒血癥、疾病過(guò)程、早期診斷、判斷預(yù)后和抗病毒藥物的體外篩選十分重要。在SIV諸多結(jié)構(gòu)蛋白中，衣殼蛋白p27因氨

2、基酸序列保守，且具有群抗原性，被認(rèn)為是抗原檢測(cè)的標(biāo)志物。故本研究選擇以純化的SIVp27蛋白為免疫原制備單克隆抗體，進(jìn)而依據(jù)雙抗體夾心ELISA的原理，初步應(yīng)用鼠抗SIVp27單克隆抗體，探索構(gòu)建檢測(cè)SIVp27抗原的試劑體系，以期成為今后艾滋病及其相關(guān)研究的有效方法。 本研究?jī)?nèi)容主要包括兩大部分。第一部分是SIVp27單克隆抗體的制備和特性分析。我們使用質(zhì)粒重組的SIVp27蛋白免疫BALB/c小鼠，采用雜交瘤技術(shù)和半固體培養(yǎng)

3、基法建立雜交瘤細(xì)胞株，經(jīng)檢測(cè)篩選，最終保留4株能穩(wěn)定分泌SIVp27單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。使用秋水仙堿將雜交瘤細(xì)胞阻斷在細(xì)胞分裂中期，染色體核型分析表明4株細(xì)胞確為雜交瘤細(xì)胞，其分泌的單抗1C3、2B6為IgG1類(lèi)，2E12為IgG2b類(lèi)，3G3為IgG2a類(lèi)。WesternBlot和間接免疫熒光檢測(cè)表明4株單抗特異性良好，均能識(shí)別SIV的p27蛋白，與逆轉(zhuǎn)錄病毒SRV、STLV無(wú)交叉反應(yīng)，2B6、2E12與HIVp24蛋白有交叉反應(yīng)

4、。免疫熒光法檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清效價(jià)為1∶80～1∶2560，腹水效價(jià)為1∶10240～1∶40960。位點(diǎn)相加實(shí)驗(yàn)表明2E12與3G3識(shí)別不同的抗原表位。 第二部分是單克隆抗體的純化和初步應(yīng)用。我們采用辛酸-硫酸銨法和ProteinA親和層析兩種方法對(duì)不同類(lèi)別的單抗進(jìn)行純化，純化效果良好。使用簡(jiǎn)易過(guò)碘酸鈉法對(duì)單抗進(jìn)行辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記。經(jīng)抗體配對(duì)實(shí)驗(yàn)確定以2E12為包被抗體、酶標(biāo)3G3為檢測(cè)抗體，棋盤(pán)滴定法確定抗體工作濃度后

5、，探索構(gòu)建了檢測(cè)SIVp27抗原的雙抗體夾心ELISA法。應(yīng)用初步建立的雙抗體夾心ELISA法，對(duì)SIV模型猴血漿標(biāo)本和SHIV模型猴病毒分離培養(yǎng)上清標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，并將其結(jié)果與Coulter公司試劑盒檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了比較。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明自建體系可以用于SIVp27抗原的檢測(cè)，特異性良好，但靈敏度有待于進(jìn)一步提高。 本研究成功地建立了能穩(wěn)定分泌SIVp27單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，為SIV/SAIDS及其艾滋病相關(guān)研究提供了一個(gè)重要工