抗人uPAR單克隆抗體的制備和應用.pdf

1、上海醫(yī)科大學碩士學位論文抗人uPAR單克隆抗體的制備和應用姓名：于偉英申請學位級別：碩士專業(yè)：生物化學與分子生物學指導教師：朱運松20000501第一部分抗人尿激酶型纖溶酶原激活物受體(uPAR)單克隆抗體的制備和鑒定在本實驗中，我們以野生型的人uPAR純品為抗原免疫BALB／C小鼠，通過雜交瘤技術獲得了一株能穩(wěn)定分泌uPARMcAb的雜交瘤細胞株，命名為9HuPAR。用9H—uPAR誘生小鼠腹水，通過SPA親和層析柱從腹水中純化得到單

2、克隆抗體，得率為3mg／ml腹水，純度達781％，ELISA法檢測效價達1：106以上。用IsoStripTM試劑盒測定其所屬亞類為IgG，。。，分子量為150kD左右。Westernblotting結果表明uPARMcAb能特異地識別分子量為55kD的uPAR，而且其識別部位與構象無關，親和常數(shù)為125107。用uPARMcAb對95D和95C進行免疫細胞化學檢測，發(fā)現(xiàn)uPAR主要位于肺癌細胞表面及細胞質(zhì)中，其中具有高度侵襲和轉移特性

3、的95D中uPAR的表達水平明顯高于低侵襲和轉移特性的95C中uPAR的表達水平。用uPARMcAb對19例原發(fā)性肺癌組織進行免疫組織化學檢測，結果在17例(895％)中檢測到了與uPAR的顯色反應，而且主要位于肺癌細胞表面及細胞質(zhì)中。將uPARMcAb以一定的終濃度加到人工基底膜中及95D和具有高侵襲特性的乳腺癌細胞株MDAMB231(M231)細胞懸液中，在Boyden小室中進行體外侵襲和遷移能力的分析，結果顯示，經(jīng)uPARMcAb

4、處理后，95D、M231的侵襲或遷移能力明顯降低，分別下降為對照組的4840％和581％(P005)，提示此抗體在抑制腫瘤的侵襲或遷移上有一定的作用，可進一步用于腫瘤治療的研究。第二部分尿激酶型纖溶酶原激活物及其受體在肺癌組織中的表達根據(jù)腫瘤是否涉及胸膜和，或支氣管和，或有無淋巴結轉移，將39例原發(fā)性肺癌手術標本的石蠟切片分為侵襲轉移性和非侵襲轉移性肺癌兩組，凡涉及胸膜和，或支氣管和，或淋巴結有轉移的標本為侵襲轉移性肺癌(共20例)，沒

5、有這些病理改變的標本為非侵襲轉移性肺癌(共19例)。用ABC免疫組化法對uPA及其uPAR在肺癌組織中的表達進行檢測，并按照McCarthy等報道的方法對免疫組織化學染色結果進行半定量分析，即按照細胞著色的程度分成0、1、2、3四級，分別對應著無著色、輕度著色、明顯著色和深度著色。對于每張切片，計數(shù)100個相鄰細胞，統(tǒng)計出4種著色程度細胞的百分數(shù)，代表最終抗原表達程度的分值按公式∑Pii計算，其中i為細胞著色程度，取值為0、1、2、3，