基于自噬和PI3K-Akt-mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究缺血預(yù)處理對(duì)糖尿病心肌缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開(kāi)論述:
　　背景:
　　缺血/再灌注損傷（Ischemia-reperfusion injury,IRI）后心肌細(xì)胞壞死、凋亡和心室重構(gòu)是急性心肌梗死溶栓治療和手術(shù)治療后心功能不全的最主要病理生理學(xué)基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)，急性心肌缺血發(fā)生后最終的心肌梗死面積大約50％是由IRI所致。合并糖尿病時(shí)更容易發(fā)生心肌IRI，且心臟損傷程度和病死率均進(jìn)一步明顯增加，嚴(yán)重威脅人類生命健康，但機(jī)制尚不明確。探討可能的保護(hù)

2、措施以達(dá)到預(yù)防或減輕心肌IRI的目的，為臨床糖尿病合并缺血性心肌病患者的防治提供理論依據(jù)，具有良好的應(yīng)用前景。
　　缺血預(yù)處理(Ischemic preconditioning，IPC)是指通過(guò)多次短暫冠狀動(dòng)脈缺血以達(dá)到增強(qiáng)心肌對(duì)隨后長(zhǎng)時(shí)間缺血的耐受性，從而減輕心肌IRI。IPC強(qiáng)大的心肌保護(hù)作用主要表現(xiàn)為縮小IRI后心肌梗死面積、降低心律失常的發(fā)生率、減少心肌細(xì)胞凋亡和促進(jìn)心功能恢復(fù)等。IPC在IRI中發(fā)揮的作用備受人們關(guān)注，但

3、其調(diào)動(dòng)心肌內(nèi)源性保護(hù)作用的機(jī)制至今尚未被完全闡明。
　　自噬(Autophagy)是一種細(xì)胞內(nèi)防御和應(yīng)激調(diào)控機(jī)制，也是參與心肌IRI的重要機(jī)制之一。作為一種重要的物質(zhì)代謝方式，自噬的發(fā)生和發(fā)展均受到嚴(yán)格的調(diào)節(jié)和控制。自噬是由自噬相關(guān)基因(Autophagy related gene，Atg)進(jìn)行調(diào)控，其中參與調(diào)節(jié)的幾個(gè)關(guān)鍵蛋白復(fù)合物包括雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin，mTOR)、磷脂酰肌

4、醇3激酶(Phosphatidylinositol3kinase-protein kinase，PI3K)、Atg8(LC3)和Atg6(Beclin-1)等。目前已知的自噬調(diào)節(jié)途徑有多條，其中磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B(Protein kinase B)-雷帕霉素靶蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（PI3K-Akt-mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路）是自噬過(guò)程中唯一的抑制性通路?，F(xiàn)有的證據(jù)表明，自噬在IRI過(guò)程中的作用存在雙面性，發(fā)揮保護(hù)作用還是損傷作用目前尚

5、存在爭(zhēng)議。
　　糖尿病嚴(yán)重威脅人類的生命健康，不僅是缺血性心臟病的獨(dú)立危險(xiǎn)因子，而且能夠加重心肌IRI和使IPC等干預(yù)措施對(duì)心肌IRI的保護(hù)作用消失或減弱。研究發(fā)現(xiàn)，自噬及其相關(guān)的PI3K-Akt-mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在糖尿病心肌的表達(dá)發(fā)生了明顯改變，而且它們?cè)谡：吞悄虿⌒募RI中所發(fā)揮的作用并不相同。由此可見(jiàn)糖尿病心肌IRI與自噬及其相關(guān)PI3K-Akt-mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)系密切，但具體機(jī)制和它們之間的相互作用有待進(jìn)一步

6、的闡明和研究。
　　基于上述分析，設(shè)計(jì)了這個(gè)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究，旨在從離體和在體實(shí)驗(yàn)兩個(gè)層面觀察PI3K-Akt-mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在正常和糖尿病心肌IRI的表達(dá)情況，探討PI3K-Akt-mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和自噬在糖尿病心肌IRI中的作用。同時(shí)，在糖尿病心肌IRI實(shí)施IPC時(shí)分別應(yīng)用自噬激動(dòng)劑和抑制劑進(jìn)行干預(yù)，觀察其是否影響IPC對(duì)糖尿病心肌IRI的保護(hù)作用，以進(jìn)一步探討自噬調(diào)節(jié)在糖尿病心肌IRI保護(hù)機(jī)制中的作用。本實(shí)驗(yàn)共分四個(gè)部

7、分:
　　第一部分 心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷模型和缺氧預(yù)處理模型的建立
　　本部分實(shí)驗(yàn)的目的是構(gòu)建成熟、穩(wěn)定且高質(zhì)量的原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)方法，采用三氣培養(yǎng)箱培養(yǎng)構(gòu)建新生鼠離體心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧(Anoxia/reoxygention，AR)損傷模型，并在此基礎(chǔ)上通過(guò)觀察心肌細(xì)胞凋亡情況，探索最佳的缺氧預(yù)處理方式。
　　結(jié)果顯示，倒置相差顯微鏡下觀察，48～72h后心肌細(xì)胞出現(xiàn)同步化搏動(dòng)，形成功能上的合胞體、收縮有力、活性高

8、。cTnT免疫熒光法復(fù)合細(xì)胞核DAPI染色法鑒定的心肌細(xì)胞純度達(dá)到（94.4±1.2）％。
　　與S組相比，各處理組的心肌細(xì)胞LDH漏出率、早期凋亡細(xì)胞百分比和晚期凋亡細(xì)胞百分比均明顯升高，正常細(xì)胞百分比明顯降低。與3h/6h組相比，6h/6h組心肌細(xì)胞LDH漏出率、早期凋亡細(xì)胞百分比和晚期凋亡細(xì)胞百分比均明顯升高，正常細(xì)胞百分比明顯降低;30min*3h/6h組，心肌細(xì)胞LDH漏出率明顯降低，正常細(xì)胞百分比明顯升高。與6h/6h

9、組相比，30min*6h/6h組心肌細(xì)胞LDH漏出率、早期凋亡細(xì)胞百分比和晚期凋亡細(xì)胞百分比均明顯降低，正常細(xì)胞百分比明顯升高。
　　第二部分 自噬和PI3K-Akt-mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在缺氧預(yù)處理對(duì)高糖心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷保護(hù)中作用的實(shí)驗(yàn)研究
　　本部分實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖怯^察自噬及其相關(guān)PI3K-Akt-mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在正常和高糖培養(yǎng)心肌細(xì)胞缺氧預(yù)處理中的表達(dá)，旨在探討缺氧預(yù)處理對(duì)高糖心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷保護(hù)作用的改變

10、及其相關(guān)機(jī)制。
　　結(jié)果顯示:與C組相比，HPC組的心肌細(xì)胞LDH漏出率明顯降低（P＜0.01）。與HC組相比，HHPC組的心肌細(xì)胞LDH漏出率無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。與HPC組相比，HHPC組的心肌細(xì)胞LDH漏出率明顯升高(P＜0.01)。
　　與C組相比，HPC組的心肌細(xì)胞早期和晚期凋亡細(xì)胞百分比均明顯降低，正常細(xì)胞百分比明顯升高（P＜0.05）。與HC組相比，HHPC組的心肌細(xì)胞早期凋亡細(xì)胞百分比、晚期凋亡細(xì)

11、胞百分比和正常細(xì)胞百分比均無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。與HPC組相比，HHPC組早期和晚期凋亡細(xì)胞百分比均明顯升高(P＜0.01)。
　　與S組相比，各處理組心肌細(xì)胞LC3-Ⅱ表達(dá)明顯升高(P＜0.05)，mTOR和PI3K表達(dá)明顯降低(P＜0.05);HS組、C組、HC組和HHPC組的Beclin-1表達(dá)明顯升高（P＜0.05），P-Akt/Akt比值明顯降低（P＜0.05）。
　　與C組相比，HPC組心肌細(xì)胞LC3

12、-Ⅱ和Beclin-1表達(dá)明顯降低（P＜0.05），mTOR表達(dá)明顯升高(P＜0.05);HC組Beclin-1表達(dá)明顯升高(P＜0.05)，mTOR表達(dá)明顯降低(P＜0.05)，LC3-Ⅱ表達(dá)有升高趨勢(shì)但無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　與HC組相比，HHPC組mTOR表達(dá)明顯升高(P＜0.05)，PI3K表達(dá)明顯降低(P＜0.05)。與HPC組相比，HHPC組LC3-Ⅱ和Beclin-1表達(dá)明顯增加(P＜0.05)，mT

13、OR、PI3K表達(dá)和P-Akt/Akt比值明顯降低(P＜0.05)。
　　第三部分:缺血預(yù)處理對(duì)正常和糖尿病心肌缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用和機(jī)制
　　本部分實(shí)驗(yàn)旨在觀察自噬在正常和糖尿病心肌IRI后的表達(dá)水平，比較IPC對(duì)正常和糖尿病心肌IRI的影響，探討自噬在其中的作用。
　　結(jié)果顯示，各組大鼠的一般情況、心肌缺血前血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)基礎(chǔ)值比較差異均無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在缺血期和再灌注期，與C組相比，IPC組發(fā)生室性心律失

14、常的大鼠數(shù)目明顯減少，并且室性心律失常評(píng)分降低，DC組發(fā)生室性心律失常的大鼠數(shù)目明顯增多，并且室性心律失常評(píng)分增高。與DC組相比，DIPC組發(fā)生室性心律失常的大鼠數(shù)目和室性心律失常評(píng)分無(wú)明顯差異。
　　第四部分 自噬和PI3K-Akt-mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在缺血預(yù)處理對(duì)糖尿病心肌缺血/再灌注損傷保護(hù)中作用的實(shí)驗(yàn)研究
　　根據(jù)第三部分的研究結(jié)果，IPC對(duì)正常心肌IRI具有保護(hù)作用，而對(duì)糖尿病心肌IRI無(wú)明顯保護(hù)性作用，因此設(shè)計(jì)

15、了這部分實(shí)驗(yàn)，在IPC中分別采用自噬激動(dòng)劑（雷帕霉素）和抑制劑（渥曼青霉素）進(jìn)行干預(yù)，觀察PI3K-Akt-mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和自噬的改變，旨在評(píng)價(jià)在自噬干預(yù)情況下IPC能否對(duì)糖尿病心肌IRI產(chǎn)生保護(hù)作用。
　　結(jié)果顯示，各組大鼠的一般情況、心肌缺血前血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)的基礎(chǔ)值比較差異均無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與DS組相比，各處理組IS％值、血清cTnⅠ和CK-MB濃度均明顯升高(P＜0.05)。與DC組相比，Wo+DIPC組IS％值、血

16、清cTnⅠ和CK-MB濃度均明顯降低(P＜0.05);Wo+DIRI組IS％值、血清cTnⅠ和CK-MB濃度均有降低趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);Ra+DIRI組和Ra+DIPC組IS％值、血清cTnⅠ和CK-MB濃度均無(wú)顯著差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.通過(guò)缺氧6h/復(fù)氧6h能夠成功構(gòu)建離體心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷模型;缺氧30min/復(fù)氧30min后再進(jìn)行缺氧6h/復(fù)氧6h能夠成功構(gòu)建離體心肌細(xì)胞缺氧

17、預(yù)處理模型。
　　2.高糖培養(yǎng)和缺氧/復(fù)氧損傷均可導(dǎo)致心肌細(xì)胞自噬抑制性通路PI3K-Akt-mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路表達(dá)減弱和自噬相關(guān)激動(dòng)蛋白表達(dá)增強(qiáng)。
　　3.缺氧30min復(fù)氧30min的缺氧預(yù)處理可對(duì)正常培養(yǎng)心肌細(xì)胞的缺氧/復(fù)氧損傷產(chǎn)生保護(hù)作用，且使PI3K-Akt-mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路表達(dá)明顯增強(qiáng);但缺氧預(yù)處理對(duì)高糖培養(yǎng)心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷無(wú)明顯保護(hù)作用，且不影響PI3K-Akt-mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路表達(dá)。