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文檔簡介
1、研究背景:
冠心病是心血管疾病中引起死亡的首要原因。冠脈狹窄引起心肌缺血甚至心肌梗死(心梗)與病死率密切相關(guān),缺血時間越長,心梗面積越大,患者預后越差。盡快恢復心肌灌注,挽救瀕死心肌,防止梗死擴大是急性心梗的基本治療原則。然而,再灌注會引起再灌注損傷(ischemia/reperfusion injury,I/R損傷)。I/R損傷的機制包括氧自由基生成增加、鈣超載、炎癥反應、線粒體損傷、細胞凋亡、內(nèi)皮細胞活化和損傷以及自噬
2、等。其中自噬是目前研究的熱點,被認為在心肌缺血-再灌注損傷中發(fā)揮著非常重要的作用。
自噬是溶酶體介導的對長命蛋白質(zhì)和損傷細胞器進行回收的過程,對線粒體等細胞器的降解和周轉(zhuǎn)起關(guān)鍵作用。在I/R時,細胞內(nèi)ATP減少以及AMP激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)活性增高均可激活自噬信號通路。另外,唯BH3域蛋白的表達上調(diào)、細胞內(nèi)鈣離子濃度增加、活性氧分子(reactive oxyg
3、en species,ROS)、過量的一氧化氮、線粒體通透性轉(zhuǎn)運孔的開放、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和非折疊蛋白反應(unfolded protein response,UPR)等均可促進心肌細胞的自噬。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號通路、Ras/cAMP依賴的蛋白激酶A通路、胰島素/生長因子信號通路以及LKB(1)-AMPK通路調(diào)節(jié)著自噬活性。在真核細胞中,雷帕霉素可抑制mTOR而激
4、活自噬,而3-甲基腺嘌呤、渥曼青霉素等可通過抑制磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)而抑制自噬。
線粒體是心肌細胞總含量最豐富的細胞器,其對于維持細胞功能非常重要。心肌細胞I/R會導致線粒體功能障礙,主要表現(xiàn)為線粒體膜電位除極化以及線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)開放。線粒體功能障礙可以使
5、心肌ATP減少,氧自由基生成以及促凋亡蛋白釋放,造成細胞死亡。氧自由基又可以進一步加重線粒體損傷,形成惡性循環(huán)。線粒體膜電位除極化、線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放以及氧自由基均可激活自噬,后者清除損傷的線粒體,從而挽救瀕死的心肌細胞。然而,當自噬過度激活時,自噬可過度清除細胞內(nèi)的細胞器,從而引起細胞自噬性死亡。
大量文獻報道在心肌細胞缺氧/復氧(anoxia/reoxygen,A/R)以及心肌I/R時,自噬活性上調(diào)。但在A/R或I
6、/R的時程與自噬活性的關(guān)系上存在爭議。有研究認為缺血或缺氧時間過短不改變自噬活性,也有報告顯示缺血抑制而再灌注上調(diào)自噬活性,甚至有研究提出缺血期的自噬增強保護心肌,而再灌注期的自噬增強則損害心肌。多數(shù)研究報告嚙齒類動物缺血超過30min和/或再灌注時間超過2h均可促進心肌細胞的自噬。不少研究認為自噬的增強對缺血心肌有保護作用,但同樣也有不少研究認為自噬加重心肌損傷。
關(guān)于自噬在I/R的作用之所以會產(chǎn)生如此大的分歧,可能與實
7、驗設計和研究手段的局限性有關(guān)。文獻報道的相關(guān)研究,多是對單一I/R狀態(tài)下的集中研究,而沒有對不同I/R狀態(tài)下自噬功能作用進行比較性研究。比如,輕度和重度I/R損傷時,自噬增強所產(chǎn)生的作用未必是一樣的。我們設想,過低或過高的自噬可能都是有害的,那么用基因敲除和過表達的研究手段得出的結(jié)果應該謹慎解釋。如果能確定心肌I/R損傷時自噬的“安全范圍”,則有望操控自噬活性來達到治療目的。
研究目的:
在新生大鼠心肌細胞培
8、養(yǎng)的A/R模型和小鼠心肌I/R模型中,觀察不同的缺氧時間和缺血時間對自噬活性的影響,并用自噬增強劑雷帕霉素和自噬抑制劑渥曼青霉素調(diào)節(jié)自噬,來研究自噬在心肌細胞A/R及心肌I/R中的作用及其機制,借此闡明自噬在I/R損傷中的作用機制,為心肌的I/R損傷提供有效的治療靶點。
方法:
1.離體研究
分離1-2日齡SD乳鼠中心肌細胞,按常規(guī)進行原代培養(yǎng),做下列檢測:(1)4,5-二甲基-2-噻唑基(2,
9、5-diphenyltetrazolium bromide,MTT)法檢測細胞生存率,設對照組、雷帕霉素組和渥曼青霉素組,置于缺氧孵箱中分別缺氧0h、6h、和24h,然后復氧4h,MTT比色,于分光光度儀下測吸光度值,比較各組細胞生存率變化。(2)凋亡檢測將心肌細胞接種于激光共聚焦小皿,設對照組、雷帕霉素(200nM)和渥曼青霉素(200nM)組,藥物預處理30min后,置于缺氧孵箱中分別缺氧0h、6h和24h,復氧4h。用Hoechs
10、t 33258染核,檢測心肌細胞凋亡率。(3)檢測自噬將細胞接種于6孔板或激光共聚焦小皿,單丹磺酰尸胺(monodansylcadaverine,MDC)染色后用激光共聚焦檢測其熒光信號,定量分析自噬活性;或?qū)⒓毎靡让赶?、離心后用戊二醛固定,電鏡檢測其中自噬體形成;或提取細胞總蛋白,用免疫印跡(western blot)分別檢測LC3-Ⅱ和Beclin(1)的表達水平。(4)檢測mPTP開放,將鈣黃綠素和氯化鈷與心肌細胞共孵育30m
11、in后,磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)漂洗3次,胰酶消化后,用等體積含10%胎牛血清DMEM/F12終止消化,流式細胞儀檢測其熒光強度。激光共聚焦檢測mPTP:將鈣黃綠素和氯化鈷與心肌細胞共孵育30min后,PBS漂洗3次,激光共聚焦檢測。(5)線粒體膜電位除極化檢測:將JC-1探針與心肌細胞共孵育30min后,PBS漂洗3次,激光共聚焦檢測線粒體膜電位除極化水平。
2.在體研究
12、
在動物水平上,將8-10周齡C57BL/6J小鼠分為對照組、雷帕霉素組和渥曼青霉素組,腹腔注射藥物30min后,麻醉,人工呼吸,左側(cè)第4肋間開胸,暴露心臟,結(jié)扎左冠狀動脈,分別缺血40min后松開結(jié)扎,恢復冠脈灌注。假手術(shù)組只開胸不結(jié)扎。觀察指標:酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法檢測血清乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase,LDH)、2,
13、3,5—氯化三苯基四氮唑(tetracycline,TTC)法測定心梗面積、超聲檢查左室內(nèi)徑和收縮功能、免疫印跡及電鏡檢查自噬水平。
計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準誤(mean±SE)表示,統(tǒng)計分析采用SPSS16.0軟件完成,多重比較采用One-WayANOVA,兩兩比較采用LSD法。計量資料用卡方檢驗。P<0.05被認為有統(tǒng)計學意義。
結(jié)果:
1.心肌細胞自噬活性隨缺氧時間延長而增強
M
14、DC和自噬體上的酸性物質(zhì)結(jié)合顯示為藍色,在自噬形成的時候會聚集成團塊狀。我們發(fā)現(xiàn)隨著缺氧時間延長,心肌細胞中藍色顆粒數(shù)量及面積均顯著增多(P<0.05)。在電鏡觀察下,自噬體為特有的雙層膜結(jié)構(gòu),內(nèi)含有損傷的細胞器。結(jié)果顯示,細胞內(nèi)的自噬體數(shù)量隨著缺氧時間延長而明顯增加(P<0.05)。用western blot檢測LC3-Ⅱ和Bclin(1)時發(fā)現(xiàn),缺氧使LC3-Ⅱ和Bclin(1)蛋白表達量顯著增加。
2.干預自噬對A/
15、R心肌細胞生存的影響
將藥物預處理心肌細胞30min后,分別進行缺氧6-24h后復氧4h。在缺氧6h時,心肌細胞存活率顯著下降,自噬增強劑雷帕霉素增加缺氧心肌細胞的存活率,而自噬抑制劑渥曼青霉素則降低細胞存活率。而在缺氧24h時,雷帕霉素降低心肌細胞存活率,渥曼青霉素則改善細胞生存率。
3.干預自噬對A/R心肌細胞凋亡和自噬性死亡的影響
用Hoechst 33258來染核,凋亡細胞核固縮,被染成
16、亮藍色。在非用藥的A/R組,隨著缺氧時間延長,凋亡細胞核逐漸增加。在常氧組,雷帕霉素和渥曼青霉素對細胞凋亡率無影響。但是將心肌細胞缺氧6h、24h,復氧4h組,雷帕霉素處理組均可使心肌細胞凋亡率下降,而渥曼青霉素增加凋亡。然而用電鏡觀察細胞自噬性死亡,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在缺氧6h的A/R組,雷帕霉素和渥曼青霉素對自噬性死亡無明顯影響,而在缺氧24h的A/R組,雷帕霉素增加自噬性死亡,渥曼青霉素則抑制之。
4.干預自噬對線粒體功能的影
17、響
用鈣黃綠素和氯化鈷共孵育的方法來檢測心肌細胞mPTP開放情況,隨著缺氧時間延長,流式細胞儀檢測到的線粒體平均熒光強度下降,表明心肌細胞線粒體轉(zhuǎn)換孔開放增加。用激光共聚焦檢測細胞內(nèi)綠色熒光強度,增加則表明mPTP開放降低,線粒體功能穩(wěn)定。結(jié)果與流式細胞儀檢測結(jié)果一致。熒光探針JC-1可以作為線粒體膜電位的指示劑,其紅/綠熒光的比值可以反應線粒體膜電位的變化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著缺氧時間延長,線粒體紅/綠熒光比值逐漸下降,表明
18、線粒體膜電位除極化增加。
雷帕霉素和渥曼青霉素不明顯改變常氧心肌細胞mPTP的開放程度。在輕度缺氧時(6h),雷帕霉素可降低mPTP的開放,而渥曼青霉素作用相反。但在缺氧24h的A/R組,雷帕霉素由于增強自噬而導致線粒體數(shù)量減少,從而降低線粒體內(nèi)的熒光強度,而渥曼青霉素仍會繼續(xù)增加mPTP的開放。
5.干預自噬對I/R心肌細胞LDH釋放及心梗面積的影響
小鼠心肌缺血15min及40min,再灌注
19、24h時,加上缺血24h共三組,心梗面積和血清LDH依次增加。在缺血40minI/R組,雷帕霉素可顯著縮小心梗面積、減少LDH的釋放,渥曼青霉素的作用效果相反。在缺血24h組,雷帕霉素反而增加心梗面積,而渥曼青霉素則縮小之。電鏡檢測顯示各組的自噬水平也是依次增加,雷帕霉素增加心肌細胞自噬,而渥曼青霉素則抑制之。
結(jié)論:
1.缺氧或缺血時間延長可導致心肌細胞自噬活性增強,提示自噬活性與損傷程度關(guān)聯(lián)。
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