自噬在心肌缺血-再灌注損傷中的不同作用.pdf

1、研究背景：
　　 冠心病是心血管疾病中引起死亡的首要原因。冠脈狹窄引起心肌缺血甚至心肌梗死（心梗）與病死率密切相關(guān)，缺血時(shí)間越長(zhǎng)，心梗面積越大，患者預(yù)后越差。盡快恢復(fù)心肌灌注，挽救瀕死心肌，防止梗死擴(kuò)大是急性心梗的基本治療原則。然而，再灌注會(huì)引起再灌注損傷（ischemia/reperfusion injury，I/R損傷）。I/R損傷的機(jī)制包括氧自由基生成增加、鈣超載、炎癥反應(yīng)、線(xiàn)粒體損傷、細(xì)胞凋亡、內(nèi)皮細(xì)胞活化和損傷以及自噬

2、等。其中自噬是目前研究的熱點(diǎn)，被認(rèn)為在心肌缺血-再灌注損傷中發(fā)揮著非常重要的作用。
　　 自噬是溶酶體介導(dǎo)的對(duì)長(zhǎng)命蛋白質(zhì)和損傷細(xì)胞器進(jìn)行回收的過(guò)程，對(duì)線(xiàn)粒體等細(xì)胞器的降解和周轉(zhuǎn)起關(guān)鍵作用。在I/R時(shí)，細(xì)胞內(nèi)ATP減少以及AMP激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)活性增高均可激活自噬信號(hào)通路。另外，唯BH3域蛋白的表達(dá)上調(diào)、細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加、活性氧分子(reactive oxyg

3、en species，ROS)、過(guò)量的一氧化氮、線(xiàn)粒體通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔的開(kāi)放、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和非折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)等均可促進(jìn)心肌細(xì)胞的自噬。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號(hào)通路、Ras/cAMP依賴(lài)的蛋白激酶A通路、胰島素/生長(zhǎng)因子信號(hào)通路以及LKB(1)-AMPK通路調(diào)節(jié)著自噬活性。在真核細(xì)胞中，雷帕霉素可抑制mTOR而激

4、活自噬，而3-甲基腺嘌呤、渥曼青霉素等可通過(guò)抑制磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)而抑制自噬。
　　 線(xiàn)粒體是心肌細(xì)胞總含量最豐富的細(xì)胞器，其對(duì)于維持細(xì)胞功能非常重要。心肌細(xì)胞I/R會(huì)導(dǎo)致線(xiàn)粒體功能障礙，主要表現(xiàn)為線(xiàn)粒體膜電位除極化以及線(xiàn)粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）開(kāi)放。線(xiàn)粒體功能障礙可以使

5、心肌ATP減少，氧自由基生成以及促凋亡蛋白釋放，造成細(xì)胞死亡。氧自由基又可以進(jìn)一步加重線(xiàn)粒體損傷，形成惡性循環(huán)。線(xiàn)粒體膜電位除極化、線(xiàn)粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放以及氧自由基均可激活自噬，后者清除損傷的線(xiàn)粒體，從而挽救瀕死的心肌細(xì)胞。然而，當(dāng)自噬過(guò)度激活時(shí)，自噬可過(guò)度清除細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器，從而引起細(xì)胞自噬性死亡。
　　 大量文獻(xiàn)報(bào)道在心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧(anoxia/reoxygen，A/R)以及心肌I/R時(shí)，自噬活性上調(diào)。但在A/R或I

6、/R的時(shí)程與自噬活性的關(guān)系上存在爭(zhēng)議。有研究認(rèn)為缺血或缺氧時(shí)間過(guò)短不改變自噬活性，也有報(bào)告顯示缺血抑制而再灌注上調(diào)自噬活性，甚至有研究提出缺血期的自噬增強(qiáng)保護(hù)心肌，而再灌注期的自噬增強(qiáng)則損害心肌。多數(shù)研究報(bào)告嚙齒類(lèi)動(dòng)物缺血超過(guò)30min和/或再灌注時(shí)間超過(guò)2h均可促進(jìn)心肌細(xì)胞的自噬。不少研究認(rèn)為自噬的增強(qiáng)對(duì)缺血心肌有保護(hù)作用，但同樣也有不少研究認(rèn)為自噬加重心肌損傷。
　　 關(guān)于自噬在I/R的作用之所以會(huì)產(chǎn)生如此大的分歧，可能與實(shí)

7、驗(yàn)設(shè)計(jì)和研究手段的局限性有關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道的相關(guān)研究，多是對(duì)單一I/R狀態(tài)下的集中研究，而沒(méi)有對(duì)不同I/R狀態(tài)下自噬功能作用進(jìn)行比較性研究。比如，輕度和重度I/R損傷時(shí)，自噬增強(qiáng)所產(chǎn)生的作用未必是一樣的。我們?cè)O(shè)想，過(guò)低或過(guò)高的自噬可能都是有害的，那么用基因敲除和過(guò)表達(dá)的研究手段得出的結(jié)果應(yīng)該謹(jǐn)慎解釋。如果能確定心肌I/R損傷時(shí)自噬的“安全范圍”，則有望操控自噬活性來(lái)達(dá)到治療目的。
　　 研究目的：
　　 在新生大鼠心肌細(xì)胞培

8、養(yǎng)的A/R模型和小鼠心肌I/R模型中，觀察不同的缺氧時(shí)間和缺血時(shí)間對(duì)自噬活性的影響，并用自噬增強(qiáng)劑雷帕霉素和自噬抑制劑渥曼青霉素調(diào)節(jié)自噬，來(lái)研究自噬在心肌細(xì)胞A/R及心肌I/R中的作用及其機(jī)制，借此闡明自噬在I/R損傷中的作用機(jī)制，為心肌的I/R損傷提供有效的治療靶點(diǎn)。
　　 方法：
　　 1.離體研究
　　 分離1-2日齡SD乳鼠中心肌細(xì)胞，按常規(guī)進(jìn)行原代培養(yǎng)，做下列檢測(cè):(1)4，5-二甲基-2-噻唑基(2，

9、5-diphenyltetrazolium bromide，MTT)法檢測(cè)細(xì)胞生存率，設(shè)對(duì)照組、雷帕霉素組和渥曼青霉素組，置于缺氧孵箱中分別缺氧0h、6h、和24h，然后復(fù)氧4h，MTT比色，于分光光度儀下測(cè)吸光度值，比較各組細(xì)胞生存率變化。(2)凋亡檢測(cè)將心肌細(xì)胞接種于激光共聚焦小皿，設(shè)對(duì)照組、雷帕霉素（200nM）和渥曼青霉素(200nM)組，藥物預(yù)處理30min后，置于缺氧孵箱中分別缺氧0h、6h和24h，復(fù)氧4h。用Hoechs

10、t 33258染核，檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率。(3)檢測(cè)自噬將細(xì)胞接種于6孔板或激光共聚焦小皿，單丹磺酰尸胺(monodansylcadaverine，MDC)染色后用激光共聚焦檢測(cè)其熒光信號(hào)，定量分析自噬活性;或?qū)⒓?xì)胞用胰酶消化、離心后用戊二醛固定，電鏡檢測(cè)其中自噬體形成;或提取細(xì)胞總蛋白，用免疫印跡(western blot)分別檢測(cè)LC3-Ⅱ和Beclin(1)的表達(dá)水平。(4)檢測(cè)mPTP開(kāi)放，將鈣黃綠素和氯化鈷與心肌細(xì)胞共孵育30m

11、in后，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）漂洗3次，胰酶消化后，用等體積含10％胎牛血清DMEM/F12終止消化，流式細(xì)胞儀檢測(cè)其熒光強(qiáng)度。激光共聚焦檢測(cè)mPTP:將鈣黃綠素和氯化鈷與心肌細(xì)胞共孵育30min后，PBS漂洗3次，激光共聚焦檢測(cè)。(5)線(xiàn)粒體膜電位除極化檢測(cè):將JC-1探針與心肌細(xì)胞共孵育30min后，PBS漂洗3次，激光共聚焦檢測(cè)線(xiàn)粒體膜電位除極化水平。
　　 2.在體研究

12、
　　 在動(dòng)物水平上，將8-10周齡C57BL/6J小鼠分為對(duì)照組、雷帕霉素組和渥曼青霉素組，腹腔注射藥物30min后，麻醉，人工呼吸，左側(cè)第4肋間開(kāi)胸，暴露心臟，結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈，分別缺血40min后松開(kāi)結(jié)扎，恢復(fù)冠脈灌注。假手術(shù)組只開(kāi)胸不結(jié)扎。觀察指標(biāo):酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法檢測(cè)血清乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)、2，

13、3，5—氯化三苯基四氮唑(tetracycline，TTC)法測(cè)定心梗面積、超聲檢查左室內(nèi)徑和收縮功能、免疫印跡及電鏡檢查自噬水平。
　　 計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)表示，統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS16.0軟件完成，多重比較采用One-WayANOVA，兩兩比較采用LSD法。計(jì)量資料用卡方檢驗(yàn)。P＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.心肌細(xì)胞自噬活性隨缺氧時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)
　　 M

14、DC和自噬體上的酸性物質(zhì)結(jié)合顯示為藍(lán)色，在自噬形成的時(shí)候會(huì)聚集成團(tuán)塊狀。我們發(fā)現(xiàn)隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng)，心肌細(xì)胞中藍(lán)色顆粒數(shù)量及面積均顯著增多(P＜0.05)。在電鏡觀察下，自噬體為特有的雙層膜結(jié)構(gòu)，內(nèi)含有損傷的細(xì)胞器。結(jié)果顯示，細(xì)胞內(nèi)的自噬體數(shù)量隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng)而明顯增加(P＜0.05)。用western blot檢測(cè)LC3-Ⅱ和Bclin(1)時(shí)發(fā)現(xiàn)，缺氧使LC3-Ⅱ和Bclin(1)蛋白表達(dá)量顯著增加。
　　 2.干預(yù)自噬對(duì)A/

15、R心肌細(xì)胞生存的影響
　　 將藥物預(yù)處理心肌細(xì)胞30min后，分別進(jìn)行缺氧6-24h后復(fù)氧4h。在缺氧6h時(shí)，心肌細(xì)胞存活率顯著下降，自噬增強(qiáng)劑雷帕霉素增加缺氧心肌細(xì)胞的存活率，而自噬抑制劑渥曼青霉素則降低細(xì)胞存活率。而在缺氧24h時(shí)，雷帕霉素降低心肌細(xì)胞存活率，渥曼青霉素則改善細(xì)胞生存率。
　　 3.干預(yù)自噬對(duì)A/R心肌細(xì)胞凋亡和自噬性死亡的影響
　　 用Hoechst 33258來(lái)染核，凋亡細(xì)胞核固縮，被染成

16、亮藍(lán)色。在非用藥的A/R組，隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng)，凋亡細(xì)胞核逐漸增加。在常氧組，雷帕霉素和渥曼青霉素對(duì)細(xì)胞凋亡率無(wú)影響。但是將心肌細(xì)胞缺氧6h、24h，復(fù)氧4h組，雷帕霉素處理組均可使心肌細(xì)胞凋亡率下降，而渥曼青霉素增加凋亡。然而用電鏡觀察細(xì)胞自噬性死亡，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在缺氧6h的A/R組，雷帕霉素和渥曼青霉素對(duì)自噬性死亡無(wú)明顯影響，而在缺氧24h的A/R組，雷帕霉素增加自噬性死亡，渥曼青霉素則抑制之。
　　 4.干預(yù)自噬對(duì)線(xiàn)粒體功能的影

17、響
　　 用鈣黃綠素和氯化鈷共孵育的方法來(lái)檢測(cè)心肌細(xì)胞mPTP開(kāi)放情況，隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)到的線(xiàn)粒體平均熒光強(qiáng)度下降，表明心肌細(xì)胞線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放增加。用激光共聚焦檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)綠色熒光強(qiáng)度，增加則表明mPTP開(kāi)放降低，線(xiàn)粒體功能穩(wěn)定。結(jié)果與流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果一致。熒光探針JC-1可以作為線(xiàn)粒體膜電位的指示劑，其紅/綠熒光的比值可以反應(yīng)線(xiàn)粒體膜電位的變化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng)，線(xiàn)粒體紅/綠熒光比值逐漸下降，表明

18、線(xiàn)粒體膜電位除極化增加。
　　 雷帕霉素和渥曼青霉素不明顯改變常氧心肌細(xì)胞mPTP的開(kāi)放程度。在輕度缺氧時(shí)(6h)，雷帕霉素可降低mPTP的開(kāi)放，而渥曼青霉素作用相反。但在缺氧24h的A/R組，雷帕霉素由于增強(qiáng)自噬而導(dǎo)致線(xiàn)粒體數(shù)量減少，從而降低線(xiàn)粒體內(nèi)的熒光強(qiáng)度，而渥曼青霉素仍會(huì)繼續(xù)增加mPTP的開(kāi)放。
　　 5.干預(yù)自噬對(duì)I/R心肌細(xì)胞LDH釋放及心梗面積的影響
　　 小鼠心肌缺血15min及40min，再灌注

19、24h時(shí)，加上缺血24h共三組，心梗面積和血清LDH依次增加。在缺血40minI/R組，雷帕霉素可顯著縮小心梗面積、減少LDH的釋放，渥曼青霉素的作用效果相反。在缺血24h組，雷帕霉素反而增加心梗面積，而渥曼青霉素則縮小之。電鏡檢測(cè)顯示各組的自噬水平也是依次增加，雷帕霉素增加心肌細(xì)胞自噬，而渥曼青霉素則抑制之。
　　 結(jié)論：
　　 1.缺氧或缺血時(shí)間延長(zhǎng)可導(dǎo)致心肌細(xì)胞自噬活性增強(qiáng)，提示自噬活性與損傷程度關(guān)聯(lián)。