腎茶對高尿酸血癥及痛風(fēng)性腎病腎損害的保護作用及機制研究.pdf

1、研究目的:高尿酸血癥是一種指尿酸合成增加和（或）尿酸排泄減少所引起的代謝性疾病。痛風(fēng)性腎病是一種由高尿酸血癥導(dǎo)致腎臟內(nèi)尿酸鹽微結(jié)晶沉積，引起間質(zhì)炎癥反應(yīng)，腎小管阻塞及腎單位喪失的疾病，以腎間質(zhì)和腎小管內(nèi)出現(xiàn)尿酸鹽沉積，腎小管上皮細(xì)胞腫脹甚至壞死為主要病理特征。高尿酸血癥是痛風(fēng)性腎病的重要理化基礎(chǔ)，以尿酸轉(zhuǎn)運蛋白調(diào)控異常為主要發(fā)病機制。因此，考慮以尿酸轉(zhuǎn)運蛋白基因，腎間質(zhì)纖維化蛋白，腎損傷蛋白的調(diào)控為藥物的靶點研究腎茶對高尿酸血癥及痛風(fēng)性

2、腎病腎臟的保護作用及機制。
　　腎茶性甘、淡，味苦、涼，具清熱除濕，排石利水之功效，在我國西雙版納和印度尼西亞等東南亞國家中常用于腎臟系統(tǒng)疾病，高尿酸血癥，痛風(fēng)的防治，療效明顯。因此，本研究通過建立高尿酸血癥和痛風(fēng)性腎病兩種動物模型，探討腎茶對高尿酸血癥和痛風(fēng)性腎病腎臟的保護作用及分子機制;通過體外建立尿酸誘導(dǎo)人腎近曲小管上皮細(xì)胞(HK-2)，構(gòu)建腎間質(zhì)纖維化細(xì)胞模型，探討腎茶對尿酸致HK-2細(xì)胞損傷的保護作用。
　　研究方

3、法:
　　1.采集15批不同產(chǎn)地的腎茶，應(yīng)用HPLC法建立腎茶的指紋圖譜，并對腎茶的迷迭香酸和咖啡酸進行含量測定。并選取15批中質(zhì)量最佳的產(chǎn)地的腎茶以Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化提取純化工藝，以得到成分穩(wěn)定的實驗用腎茶提取物。
　　2.選用KM種小鼠作為高尿酸血癥動物模型進行實驗研究，觀察腎茶提取物對高尿酸血癥小鼠血清尿酸，尿素氮，肌酐水平的影響，用HE染色觀察腎茶對小鼠腎臟病理形態(tài)學(xué)上的影響，用免疫組織化檢測腎茶對小

4、鼠腎臟尿酸轉(zhuǎn)運蛋白有機陰離子家族成員OAT1的表達，中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白(NGAL)，TIMP-1的表達。采用實時熒光定量PCR法檢測小鼠腎臟皮質(zhì)URAT1和OAT1基因的表達。采用蛋白印跡法(Western Blot)探討腎茶對小鼠腎皮質(zhì)TIMP-1、URAT1、OAT1蛋白表達的影響。
　　3.選用酵母聯(lián)合腺嘌呤的方法建立SD大鼠痛風(fēng)性腎病模型，用代謝籠收集24小時尿液，測定尿蛋白含量，觀察腎茶提取物對痛風(fēng)性腎病大鼠血

5、清尿酸，尿素氮，肌酐水平，腎臟皮質(zhì)NAG水平的影響，用HE染色觀察腎茶對大鼠腎臟病理形態(tài)學(xué)上的影響，采用實時熒光定量PCR法檢測大鼠腎臟皮質(zhì)URAT1和OAT1基因的表達。
　　4.采用蛋白芯片雙抗體夾心法技術(shù)，對痛風(fēng)性腎病大鼠中腎損傷因子進行篩選，并經(jīng)免疫組織化學(xué)和蛋白印跡法(Western Blot)進行驗證。采用Western Blot探討腎茶對大鼠腎皮質(zhì)尿酸轉(zhuǎn)運蛋白URAT1、OAT1蛋白表達的影響。
　　5.采用尿

6、酸刺激人腎近曲小管上皮細(xì)胞(HK-2)造成細(xì)胞損傷，建立腎間質(zhì)纖維化細(xì)胞模型，以腎茶提取物及其主要單體干預(yù)，通過(CCK8)法檢測腎茶HK-2對細(xì)胞的活力的影響和流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測腎茶提取物對HK-2細(xì)胞的凋亡和周期。
　　6.體外建立黃嘌呤氧化酶活性(XOD)篩選體系，采用HPLC法測定酶促反應(yīng)體系中底物黃嘌呤在反應(yīng)前后含量的變化，并用HPLC法檢測高尿酸血癥小鼠肝臟黃嘌呤的含量，以此考察腎茶對黃嘌呤氧化酶的抑制作用。采用

7、D-半乳糖復(fù)制大鼠亞急性衰老模型，通過行為學(xué)實驗和超氧化物歧化酶活性的檢測來評價腎茶對衰老大鼠的抗氧化作用。
　　研究結(jié)果:
　　1.發(fā)現(xiàn)了采集的15批樣品中云南西雙版納產(chǎn)的腎茶中迷迭香酸和咖啡酸含量最高，優(yōu)選了腎茶的最佳提取純化工藝。
　　2.生化指標(biāo)結(jié)果顯示:腎茶醇提物能有效降低高尿酸血癥小鼠血清血清尿酸，尿素氮，肌酐水平，HE染色病理觀察結(jié)果顯示:腎茶能保護小鼠腎臟;免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示:腎茶能調(diào)節(jié)小鼠腎臟尿酸轉(zhuǎn)

8、運蛋白有機陰離子家族成員(OAT1)的表達，下調(diào)腎損傷蛋白(NGAL)，(TIMP-1)的表達;實時熒光定量PCR結(jié)果顯示:腎茶能上調(diào)高尿酸血癥小鼠OAT1 mRNA的表達。Western Blot結(jié)果顯示:腎茶醇提物能降低高尿酸血癥小鼠腎組織TIMP-1、(URAT1)蛋白的表達的表達。腎茶醇提物中和腎茶總黃酮中、高劑量均能上調(diào)高尿酸血癥小鼠腎臟OAT1蛋白的表達。
　　3.生化指標(biāo)結(jié)果顯示:腎茶醇提物能有效降低痛風(fēng)性腎病大鼠血

9、清尿酸，尿素氮，肌酐水平，腎皮質(zhì)β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NGA)含量，改善大鼠腎功能;HE染色病理切片觀察結(jié)果顯示:腎茶能保護大鼠腎臟;實時熒光定量PCR結(jié)果顯示:腎茶高劑量組能上調(diào)高尿酸血癥小鼠OAT1 mRNA的表達。
　　4.蛋白芯片雙抗體夾心法結(jié)果顯示:篩選出3種腎損傷蛋白的表達有差異，發(fā)現(xiàn)腎茶醇提物高劑量能顯著降低痛風(fēng)性腎病大鼠腎組織NGAL、TIMP-1、KIM-1蛋白的表達。免疫組化的和Western Blot的