體外間歇性壓應(yīng)力對組織工程軟骨生物學作用的初步研究.pdf

1、目的：設(shè)計制作組織工程軟骨培育系統(tǒng)，體外周期性壓應(yīng)力條件下，以原代軟骨細胞和脫鈣骨基質(zhì)(DBM)材料構(gòu)建組織工程軟骨，初步觀察間歇性周期壓應(yīng)力對軟骨的增殖和分化影響，為智能化仿生組織工程培育系統(tǒng)的改進積累實驗依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.設(shè)計制作組織工程軟骨培育系統(tǒng)，包括：整機，軟骨培養(yǎng)室，施力裝置和伸縮泵。
　　 2．酶消化法分離獲得軟骨細胞，倒置顯微鏡和甲苯胺藍以及番紅O 染色觀察細胞形態(tài)；參照Urist文

2、獻中報道的改良方法自制脫鈣骨基質(zhì)(DBM)材料．，掃描電鏡觀察自制的脫鈣骨基質(zhì)結(jié)構(gòu)表面及接種細胞后細胞生長情況。
　　 3．軟骨細胞和脫鈣骨基質(zhì)材料(DBM)復合構(gòu)建組織工程化軟骨組織，分別在動態(tài)周期性應(yīng)力和靜態(tài)條件下培養(yǎng)，取實驗組和對照組樣品進行如下檢測。常規(guī)石蠟切片，HE和甲苯胺藍染色、番紅O 染色，Ⅱ型膠原免疫組化染色,光鏡下比較觀察靜態(tài)和動態(tài)周期性應(yīng)力條件下培養(yǎng)的組織工程軟骨組織學差異；收集培養(yǎng)1、3、7,10和13天的

3、標本，按MTT 試劑盒說明加樣，酶聯(lián)免疫儀490nm檢測OD值，估計各組標本中細胞的相對數(shù)，以評價周期性動態(tài)應(yīng)力對軟骨細胞的增殖的影響；取培養(yǎng)5天的標本，流式細胞儀檢測實驗組和對照組結(jié)構(gòu)細胞周期各時期細胞的百分比，G2和S 期細胞的百分比之和代表細胞的增殖率，以評價應(yīng)力對細胞周期的影響；
　　 4．取兔原代關(guān)節(jié)透明軟骨的軟骨細胞,與DBM 材料復合后培養(yǎng)，分為靜止培養(yǎng)組和予以壓應(yīng)力刺激組，五天后,植入兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損模型中。選用

4、健康日本大耳白兔15只,制造單側(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨缺損,將實驗兔分為三組：壓應(yīng)力培養(yǎng)的軟骨細胞-支架材料復合物修復組(實驗組)；靜止培養(yǎng)的軟骨細胞-支架材料復合物修復組(實驗對照組)及空白缺損對照組。于術(shù)后8周處死動物,取材對修復組織進行大體、組織學觀察。
　　 結(jié)果：
　　 1．制作的組織工程培養(yǎng)系統(tǒng)及配套設(shè)備能夠?qū)崿F(xiàn)自動化、無菌、精確壓力刺激等試驗要求。
　　 2．脫鈣骨基質(zhì)(DBM)呈白色，HE 染色未見細胞核等細

5、胞碎片殘留，結(jié)構(gòu)疏松而多孔；掃描電鏡觀察，DBM呈多孔性結(jié)構(gòu)，孔隙直徑為400～600μm，孔隙率為75％±10％；軟骨細胞在脫鈣骨基質(zhì)材料上黏附、伸展、生長良好，可見細胞分泌的胞外基質(zhì)。
　　 3．采用凝膠雙相接種法[2]構(gòu)建種子細胞-支架材料復合物，細胞-支架結(jié)構(gòu)培養(yǎng)2周后，表面可見透明軟骨組織，較光滑；石蠟切片HE 染色、甲苯胺藍染色、番紅O 染色以及二型膠原免疫組化染色，光鏡下，動態(tài)周期性應(yīng)力條件下培養(yǎng)的細胞-支架結(jié)構(gòu)與

6、對照組比較：細胞密度較大，細胞與支架結(jié)合緊密，有部分細胞已長入支架深層，且分布較均勻。MTT 檢測發(fā)現(xiàn)各時相點，除培養(yǎng)第1天各組細胞增殖無明顯差異，其余各時相點，各實驗組的細胞增殖明顯快于對照組(P＜0.05)，各實驗組壓縮幅度均可刺激細胞增殖，尤以壓縮幅度為10％組最顯著，細胞生長曲線前移，增殖高峰期延長，峰值增高；各實驗組壓縮幅度也可刺激細胞增殖，以10％幅度組最明顯。在培養(yǎng)期內(nèi)，各組細胞生長曲線變化趨勢相同，在培養(yǎng)3天～10天細胞

7、增殖明顯。壓應(yīng)力刺激使G1期細胞明顯減少(P＜0.05)，同時G2 期和S 期細胞顯著增加(P＜0.05)，壓應(yīng)力刺激可顯著增強軟骨細胞GAG表達，在相同頻率下，10％壓縮幅度對GAG 含量的刺激作用最強；，對照組與各實驗組GAG 含量著差別(P＜0.05)。
　　 4．動物實驗結(jié)果：
　　 大體觀察術(shù)后8周,實驗組(應(yīng)力刺激組)缺損修復區(qū)組織與周圍關(guān)節(jié)軟骨相整合,軟骨缺損區(qū)被光滑白色半透明的組織覆蓋,同周圍其他軟骨組織

8、外形差異較小。靜止培養(yǎng)細胞-DBM 復合物修復組的缺損區(qū)修復組織與周圍軟骨部分整合在一起,有一部分似軟骨樣修復，光澤不如實驗組及周圍正常組織；空白對照組缺損處修復較差,凹凸不平，無光澤,與周圍正常軟骨組織有較為明顯的不同。
　　 結(jié)論：
　　 1．設(shè)計制作的智能化組織工程培育裝置能夠滿足自動化培養(yǎng)，同時精確施加壓應(yīng)力刺激；2．脫鈣骨基質(zhì)(DBM)適于作為組織工程軟骨在應(yīng)力條件下培育的支架材料：自制的DBM 具有良好的親水

9、性、對軟骨細胞無毒性、在壓縮應(yīng)力條件下與軟骨細胞復合培養(yǎng)最長達2周，無支架斷裂，破碎的情況發(fā)生；3．體外壓應(yīng)力能有效促進軟骨細胞增殖：應(yīng)力對細胞增殖作用可能與應(yīng)力增加G2和S 期細胞比例，促進營養(yǎng)成分進入支架材料內(nèi)部有關(guān)；4．體外壓應(yīng)力可以增加軟骨細胞GAG分泌，其機制可能與促進細胞增殖有關(guān)；5．0.5Hz/10％的應(yīng)力可能更有效地促進細胞增殖，有希望獲得接近于正常軟骨組織的替代物。根據(jù)組織工程原理,原代軟骨細胞復合支架材料修復全層關(guān)節(jié)