轉基因同種異體組織工程軟骨修復兔關節(jié)軟骨缺損的初步研究.pdf

1、目的:應用逆轉錄病毒載體將外源性人端粒酶逆轉錄酶(hTERT)基因整合到兔關節(jié)軟骨細胞的基因組中,使其獲得永生化,并對其生物學特性進行研究。以基因轉染得到的永生化軟骨細胞為種子細胞,復合骨基質明膠(Bone Matrix Gelatin,BMG)構建組織工程軟骨,對其修復兔關節(jié)軟骨缺損的能力進行評價,從而探討轉入hTERT基因的永生化軟骨細胞作為軟骨組織工程種子細胞的可行性及BMG作為軟骨組織工程支架材料的優(yōu)越性。
　　 方法:

2、
　　 1.分離、培養(yǎng)兔關節(jié)軟骨細胞并對其特有表型進行鑒定。通過陽離子脂質體將pLEGFP-C1-hTERT質粒與-pVSV-G質粒共轉染GP2-293包裝細胞,并對轉染后72小時內收集到的病毒上清進行濃縮,再感染分離得到的第2代兔關節(jié)軟骨細胞,并觀察轉染后GP2-293細胞和軟骨細胞綠色熒光蛋白GFP的表達。使用NIH3T3細胞對病毒原液和濃縮液進行病毒滴度測定,并比較前后的變化。使用含有G418的培養(yǎng)液篩選被病毒濃縮液感染后

3、的關節(jié)軟骨細胞,將得到的克隆擴大培養(yǎng),并采用RT-PCR法檢測擴增細胞內hTERT基因的表達。擴增后的軟骨細胞在倒置顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)和生長情況,繪制細胞生長曲線和計算群體倍增時間來探討轉入hTERT基因對細胞增殖的影響。通過RT-PCR法和免疫組化染色來評價轉入hTERT基因后軟骨細胞表型的變化情況和細胞因子BMP-4對轉染后軟骨細胞表型的影響。最后通過平板克隆形成實驗觀察轉入hTERT基因后對軟骨細胞轉化傾向的影響。
　　

4、 2.制備兔骨基質明膠BMG,將得到的BMG修剪后凍干,環(huán)氧乙烷滅菌后置于-80'C保存?zhèn)溆?。將永生化軟骨細胞復合BMG生長,制備成細胞-載體復合物,并分別采用RT-PCR法和免疫組化法檢測細胞復合BMG生長3天后Ⅱ型膠原的表達情況。8只雄性新西蘭兔隨機分成A、B兩組,建立雙側股骨滑車關節(jié)面軟骨缺損的模型,每個膝關節(jié)均有兩處軟骨缺損,包含實驗組和對照組。A組:實驗組為永生化軟骨細胞復合BMG(A1),對照組為空白BMG(A2):B組:

5、實驗組為永生化軟骨細胞復合BMG(B1),對照組為第2代軟骨細胞復合BMG(B2).分別于術后6周和12周取材,行大體觀察和Moran大體評分。
　　 結果:
　　 1.得到的兔關節(jié)軟骨細胞以多角形和三角形為主,胞漿豐富,具有良好的折光性,甲苯胺藍染色和Ⅱ型膠原免疫細胞化學染色結果均呈陽性。通過pLEGFP-C1-hTERT質粒與pVSV-G質粒共轉染(3P2-293包裝細胞,細胞內可見綠色熒光蛋白GFP表達,收集到的病

6、毒上清液經(jīng)濃縮后病毒滴度明顯提高。濃縮病毒液感染兔關節(jié)軟骨細胞72小時后見軟骨細胞胞漿中有成片黃綠色熒光蛋白表達。經(jīng)G418篩選4周后最終得到克隆并將其擴增,已經(jīng)連續(xù)傳至25代,初步建立了永生化軟骨細胞系。而未經(jīng)轉染的第2代軟骨細胞經(jīng)(3418篩選1周后全部死亡。通過RT-PCR法能夠檢測到永生化軟骨細胞的hTERT基因在mRNA水平的表達。體外連續(xù)培養(yǎng)中,永生化軟骨細胞增殖活力提高,生長速度加快,群體倍增時間縮短,而細胞體積縮小并逐漸

7、拉長,呈長梭形或放射狀排列,Ⅱ型膠原免疫細胞化學染色呈陰性,RT-PCR法幾乎檢測不到Ⅱ型膠原的mRNA表達,標化后的灰度值明顯低于正常第2代軟骨細胞組和加入 BMP-4的永生化軟骨細胞組(P＜0.05)。轉入hTERT基因的軟骨細胞在體外貼壁生長的過程中具有接觸抑制性,克隆形成率僅為5.8％,遠低于Hela細胞的克隆形成率,不具備惡性轉化傾向。
　　 2.制得的BMG呈疏松多孔隙的海綿狀結構,具有一定的韌性和強度,易被修剪成各

8、種需要的形狀。去分化的永生化軟骨細胞復合BMG體外培養(yǎng)3天后,Ⅱ型膠原能夠重新被翻譯、表達。手術后6周和12周A1、B1、B2均由軟骨樣組織修復,關節(jié)面完整,修復組織與周圍正常軟骨整合滿意,而A2軟骨缺損處凹陷,其內有少量灰白色透明樣物質填充,周圍界限清楚。Moran大體評分結果顯示在兩個時間點實驗組(A1、B1)、正常陽性對照組(B2)評分結果均明顯優(yōu)于空白BM(3對照組(A2),差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。術后6周,實驗組(

9、A1、B1)及正常陽性對照組(B2)評分差異不具有統(tǒng)計學意義(P＞0.05);術后12周,實驗組(A1、B1)優(yōu)于正常陽性對照組(B2),有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。術后12周各組的得分均高于各自術后6周的得分(P＜0.05)。
　　 結論:
　　 1.通過轉入外源性hTERT基因建立了永生化軟骨細胞系,關節(jié)軟骨細胞在體外培養(yǎng)的壽命顯著延長。
　　 2.永生化軟骨細胞在體外單層培養(yǎng)的過程中表型逐漸丟失,細胞因子