重組雙功能域人補體受體1型分子的構(gòu)建及其生物功能分析.pdf

1、補體系統(tǒng)的異常過度活化是缺血再灌注損傷、異種器官移植急性排斥反應(yīng)等許多炎癥性疾病的發(fā)生利發(fā)展的重要始動因素之一。血清補體抑制水平的降低會導(dǎo)致溶尿綜合癥、陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿、腎小球腎炎及遺傳性血管源性水腫等疾病的發(fā)生。抑制補體的過度活化是治療這些疾病的一個新的思路。補體活化有經(jīng)典、旁路和甘露糖結(jié)合凝集素(MBL)三條途徑，但這三條途徑都在C3處匯合。補體1型受體( complement receptor type1，CRl)能夠結(jié)合C

2、3b和C4b，具有加速C3/C5轉(zhuǎn)化酶裂解的加速衰變活性( decay-accelerating activity DAA)和輔助I因子裂解C3b和C4b的輔助因子活性(co-factor activity CA)。由于CR1是一個多能有效的補體抑制劑，因此在CR1基礎(chǔ)上研制補體抑制劑是一個十分合理的策略。 由于CR1中的內(nèi)在同源性，在除羧基端2個SCRs外的28個SCRs形成4個大的長同源重復(fù)(long homology re

3、peat LHR)，每個由7個SCRs組成。分別稱為LHRA、LHR B、LHR C和LHR D。其中，LHRA中的前3個SCRs組成有功能性位點I，而LHR B和LHRC中的前3個SCRs組成的位點只有三個氨基酸的不同，有相同的功能，都稱為功能性位點II。 位點I能夠結(jié)合C4b，而結(jié)合C3b的能力非常微弱，對C3轉(zhuǎn)化酶有很高的加速衰變活性，但輔助I因子裂解C3b和C4b的能力比較弱。位點II能夠有效地結(jié)合C3b和C4b，結(jié)合C

4、4b的能力比結(jié)合C3b的能力弱。位點II對于C3b和C4b有很高的CA活性，但對C3轉(zhuǎn)化酶的DAA活性比較低，因此可以說一拷貝的加速衰變因子( decay-accelerating factor DAF)樣位點和2個拷貝的膜輔助蛋白(membrane cofactorprotein MCP； CD46)樣位點使CR1成為補體活化調(diào)節(jié)劑(regulators of complementactivation RCA)家族中唯一的能夠失活裂解

5、全部4種C3和C5轉(zhuǎn)化酶的多功能性分子。 試驗表明，盡管LHR A對C3轉(zhuǎn)化酶有足夠的DAA活性，但對于C5轉(zhuǎn)化酶的DAA活性較低，要使LHRA對C5轉(zhuǎn)化酶具有較好的DAA活性，其后必須跟包含有位點II的LHR B或LHR C。LHR B或LHR C的作用是結(jié)合三聚體的C5轉(zhuǎn)化酶中的C3b。 本研究從CR1分子的結(jié)構(gòu)和功能出發(fā)，利用重疊延伸PCR(splicing overlapextention PCR，SOE-PCR

6、)的方法構(gòu)建出能夠結(jié)合C3b和C4b的雙功能域CR1衍生物，并在原核系統(tǒng)中進行表達并驗證了其活性，為新型補體抑制劑的進一步研制奠定基礎(chǔ)。研究取得了以下主要結(jié)果： 1.從人外周血單個核細胞中提取總RNA，經(jīng)RT-PCR成功地克隆了編碼人補體受體I型胞外區(qū)CRl-SCRl-3的cDNA(其長度為585bp)，連接于pMD18-T simple載體后測序，序列比對發(fā)現(xiàn)與GenBank上登錄的編碼相應(yīng)補體受體I型cDNA區(qū)域序列一致。

7、 2.以構(gòu)建的含功能性片段I的T載體為模板，擴增出平端的功能性位點I；以本室構(gòu)建的pET32a-CRl-SCR15-18為模板擴增出平端的功能性片段II( CRl-SCR15-17)；利用重疊延伸PCR方法擴增出包含雙功能域的融合基因。將融合基因重組于pET32a(+)載體，成功地構(gòu)建了雙功能域的重組原核表達質(zhì)粒，命名為pET32- CR1-2D。氨芐青霉素篩選出陽性重組質(zhì)粒經(jīng)酶切及序列測定確認。 3.將構(gòu)建的pET32-

8、CR1-2D載體成功轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosetta(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達，SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)在分子量約63kDa處出現(xiàn)一條明顯表達條帶；其以包涵體形式表達；并確立pET32- CR1-2D在37℃條件下，1mmol/L IPTG誘導(dǎo)4h時，大腸桿菌中有較高的蛋白表達水平。采用抗6xHis抗體經(jīng)Western blot進一步證實了此蛋白。 4.蛋白經(jīng)Ni-NTA柱純化后，可得到單一條帶的蛋白，表明采用親和層析可實現(xiàn)Txr

9、-CRl-2D蛋白的一步純化。透析復(fù)性試驗發(fā)現(xiàn)尿素濃度梯度逐步遞減復(fù)性效果較好，最佳復(fù)性條件為：透析液中谷胱甘肽氧化型為1.5 mmol/L、還原型為3,5 mmol/L時析出蛋白較少，且補體溶血抑制實驗表明此時生物活性較好；透析復(fù)性后的蛋白經(jīng)腸激酶酶切，及隨后Ni-NTA純化后，可獲得不含外源氨基酸的重組CRl-2D蛋白。 5.體外功能試驗驗證了重組蛋白的活性。體外免疫介導(dǎo)紅細胞溶解試驗?zāi)Ｐ椭?，分光光度計方法測定上清中血紅蛋白

10、發(fā)現(xiàn)該蛋白能夠抑制紅細胞溶解；流式細胞術(shù)的方法發(fā)現(xiàn)重組蛋白能夠減少紅細胞表面C3b沉積；ELISA方法發(fā)現(xiàn)重組蛋白能夠減輕上清中C5a產(chǎn)生。這些指標一定程度上說明了CRl-2D有抑制血管內(nèi)溶血和血管外溶血的能力。在小鼠體內(nèi)建立免疫介導(dǎo)紅細胞溶解模型，流式細胞術(shù)的方法觀察了輸注紅細胞在不同時相點存活情況。證實了該重組蛋白在標記紅細胞輸注的兩小時內(nèi)能夠延長紅細胞的存活時間。 綜上所述：本實驗成功的構(gòu)建了由位于LHR A內(nèi)的功能性片段