半乳凝集素-3糖識別結構域調控肝癌細胞功能的蛋白質組學研究.pdf

1、肝癌是一種嚴重威脅人類健康的常見惡性腫瘤。根據最新的全球癌癥統(tǒng)計報告稱，2012年全球新增肝癌患者74.8萬人，同時死亡69.5萬人，新增發(fā)病率排名第六，死亡率則排名第三。目前，我國肝癌預防和診斷治療形勢仍然十分嚴峻。
　　Galectin-3是一個與HCC轉移密切相關的蛋白。在健康的肝組織中，肝細胞并不表達Galectin-3，但發(fā)生癌變的肝組織中，Galectin-3的表達是明顯上調的。在肝癌細胞系中過表達Galectin-3

2、會導致細胞增殖和侵襲能力的增強。細胞內Galectin-3主要發(fā)揮類似BCL-2家族蛋白的抗凋亡功能。在細胞外空間中，Galectin-3可以與大量的糖基化蛋白結合。依賴于Galectin-3的N端結構域介導的寡聚作用，這些糖基化受體與Galectin-3在細胞表面形成了穩(wěn)定的晶格狀結構，從而調節(jié)細胞的功能。
　　一種 N端結構域缺失的Galectin-3的特殊形式僅包含了 Galectin-3的糖識別結構域(Carbohydra

3、te recognition domain，CRD)，簡稱Gal3C，僅存在于細胞外。目前的研究發(fā)現(xiàn)， Gal3C可能在血管生成方面發(fā)揮作用，并具備一定的抑制早期腫瘤生長的作用。目前， Gal3C對HCC生長和轉移的調控機制仍然不清楚。
　　本論文針對Gal3C在HCC細胞外的功能以及其發(fā)揮功能的機制進行了研究，主要的研究目的是：1.發(fā)現(xiàn)Gal3C在HCC細胞系HepG2表面的潛在配體；2.發(fā)現(xiàn)Gal3C對表達Galectin-3

4、的HepG2細胞的生長會有何種影響；3.發(fā)現(xiàn)Gal3C發(fā)揮其調控功能的分子機制。
　　本論文結合原核共表達與光反應交聯(lián)策略、細胞生物學實驗手段以及高通量的生物質譜依賴的定量蛋白質組學研究策略，對 Gal3C在 HepG2細胞外表面的潛在配體、Gal3C對HepG2細胞生長遷移和增殖的影響、Gal3C對HepG2細胞的調控機制展開研究。
　　在本論文的第一部分主要研究了Gal3C在HepG2細胞表面的定位以及在細胞表面結合的潛

5、在配體。結合原核共表達策略和光反應活性代謝標記策略，表達了生物素標記的Gal3C重組蛋白Gal3CB以及生物素化/光反應亮氨酸雙重標的Gal3C重組蛋白Gal3CBP，并證明Gal3CBP具備了結合乳糖的能力。將Gal3CBP與HepG2細胞孵育，并用紫外線進行交聯(lián)，然后用FITC熒光顯色，顯示Gal3CBP主要結合在細胞表面，在細胞與細胞的連接處有聚集的趨勢。隨后用鏈霉親和素親和層析純化了交聯(lián)的細胞組分，對這些組分進行胰蛋白酶酶解、質

6、譜檢測和Proteome Discoverer1.4數據庫搜索分析，發(fā)現(xiàn)Gal3CBP能結合細胞膜上的糖基化蛋白。這些糖蛋白有的是膜上的受體，例如：表皮生長因子受體（EGFR），轉鐵蛋白受體（TFR1）、胰島素樣生長因子2受體（MPRI）、六磷酸甘露糖受體(MPRD)和甘露糖受體(MRC2)。另外，溶酶體相關膜糖蛋白（LAMP2），細胞表面黏附分子如整合蛋白（Integrin）家族蛋白、基質細胞驅動受體1（NPTN），活性白細胞黏附分子

7、（ALCAM）、神經細胞黏附分子（L1CAM）等與細胞黏附有關的分子也是Gal3C的結合對象。
　　第一部分的研究結果顯示，通過用具有光反應交聯(lián)活性和生物素標記的Gal3CBP，并利用質譜鑒定，發(fā)現(xiàn)了一些之前并未報道的Gal3C的結合組分，它們也是 Galectin-3在HepG2細胞膜表面的潛在配體。
　　本論文第二部分的研究研究了細胞外的Gal3CB對HepG2產生的影響。將Gal3CB添加到HepG2的培養(yǎng)體系中，然后

8、用MTT實驗分析其對HepG2生長的影響，用劃痕修復實驗和 Trans-well實驗分析其對 HepG2的生長和增殖的影響。結果顯示，細胞外過量的Gal3CB能夠抑制HepG2的生長，抑制效果隨著抑制劑量和時間的增加而增加，50μg/ml的Gal3CB處理HepG2細胞12小時，能使生長抑制率達到50％。劃痕修復結果顯示，細胞外過量的Gal3CB能夠減弱HepG2的遷移。用10μg/ml的Gal3CB處理HepG2細胞12小時后，Hep

9、G2的遷移就受到了明顯的抑制。Trans-well實驗結果顯示，細胞外的Gal3C能夠抑制HepG2細胞的侵襲能力，抑制效果隨著抑制劑量的增加而增加。
　　第二部分的研究結果顯示，如細胞外出現(xiàn)大量的Gal3C，則 HepG2的生長、遷移和侵襲都會受到一定程度的抑制。這說明，Gal3C對HCC的生長和轉移發(fā)揮負調控作用。
　　本論文第三部分的研究內容研究了50μg/ml的Gal3CB處理HepG2細胞12小時后，細胞蛋白質表達

10、譜的動態(tài)變化，并探討 Gal3CB對 HepG2細胞的調控機制。首先，利用13C(6)-Lysine和13（6）-Arginine對HepG2細胞進行SILAC標記，使輕重標記的細胞的相同肽段之間能夠產生6.03 Da的質量差，并以此作為相對定量的基礎。然后，分別用Gal3C處理重標細胞或輕標細胞，并將處理前后的細胞等量混合，混合后的蛋白進行胰蛋白酶酶切和LC-MS/MS鑒定，以獲得蛋白的表達譜以及定量信息。利用在線數據分析軟件DAVI

11、D Bioinformatics Resources6.8對鑒定到的蛋白進行基因分類和信號通路分析，用IBM SPSS Statistics19對蛋白的定量信息和分布進行統(tǒng)計學分析，用在線的蛋白質相互作用數據處理軟件String10對上下調的數據進行蛋白質間的相互作用預測，以發(fā)現(xiàn)這些發(fā)生變化的蛋白之間是否存在已經報道的或者預測的相互作用。用 WebGestalt中的Disease Association Analysis工具對這些差異表

12、達的基因進行預測，以探索它們與疾病的可能關系。用TMHMM Server v.2.0預測了差異表達蛋白的跨膜結構域。分析結果顯示，在相對應的兩次正反標記實驗中，分別鑒定到肽段數為30488和29309，蛋白數為4705和4435，重復鑒定到3703個蛋白，其中，在兩次實驗中均有定量信息的蛋白有3182個。鑒定到的蛋白涉及代謝途徑、小分子代謝、蛋白質結合以及細胞外泌體。統(tǒng)計學分析顯示，兩次實驗的均值為1.0188和1.0068，標準差為0

13、.25133和0.17903。兩次實驗的數據分布直方圖的偏度的標準誤差均為0.043，峰度的標準誤差均為0.087，兩組數據的雙側T檢驗P值＜0.01，說明數據均符合正態(tài)分布。兩組數據的Pearson相關系數為0.414，說明兩組數據相關性良好，符合實驗要求。
　　選擇蛋白表達量上下調范圍為均值的1.3倍，作為Gal3CB處理后，HepG2中表達出現(xiàn)變化趨勢的蛋白。在這個標準下，有35個蛋白的表達量發(fā)生了上調，67個蛋白的表達發(fā)生

14、了下調。其中，上調達到均值1.5倍的蛋白有11個，下調達到1.5倍的蛋白有24個。這些蛋白總的差異表達趨勢是，負調控細胞生長或細胞黏附的蛋白表達量是明顯上調的，正調控細胞生長或細胞黏附的蛋白的表達量是明顯下調的，符合本論文第二部分的細胞生物學結論。
　　String10分析發(fā)現(xiàn)，與GalCB存在相互作用或者可能發(fā)生相互作用的蛋白，大部分都與腫瘤生長與轉移相關。WebGestalt分析結果顯示，Gal3CB刺激下表達發(fā)生差異變化的蛋

15、白可以分為兩組。一組與代謝相關疾病存在密切關系，另一組則與腫瘤相關。NDRG1不僅與腫瘤密切相關，也肝移植有密切關系，說明其可能與肝臟腫瘤存在關系。TMHMM Server v.2.0預測結果顯示，在上調表達的蛋白中，有7個蛋白至少具有單次跨膜結構，在下調表達的蛋白中，至少具有單次跨膜結構的蛋白有16個，其中ALCAM是一個下調表達的跨膜蛋白，并與腫瘤密切相關。對鑒定到的差異表達蛋白進行免疫印跡驗證，結果顯示，NDRG1、CLU以及AL

16、CAM的下調表達以及S100A11、MVP和Galectin-1的上調表達均與定量蛋白質組學的鑒定結果相符合。已有的研究證實，NDRG1、CLU以及ALCAM的下調表達以及S100A11的上調表達會導致HCC細胞生長和轉移的抑制，這與之前的研究結論相符合。同時，在這些蛋白中，NDRG1對抗腫瘤藥物達沙替尼的敏感度最大。
　　第三部分的研究結果顯示，通過研究Gal3CB處理HepG2細胞后的蛋白質表達譜的動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)了Gal3C負

17、調控細胞生長的功能可能是通過調節(jié)NDRG1、CLU、ALCAM、S100A11、MVP以及Galectin-1等的表達量實現(xiàn)的。并發(fā)現(xiàn)Gal3C抑制腫瘤細胞生長轉移的機制與達沙替尼具有一定的一致性。
　　本課題主要取得了一下創(chuàng)新性發(fā)現(xiàn)：
　　1）利用代謝標記對Gal3C進行光反應活性氨基酸標記，使之具備了光反應交聯(lián)能力，實際成為了一個研究Galectin-3配體的生物探針；
　　2）首次證實細胞外Gal3C是一個Hep

18、G2的生長和轉移的負調控因子；
　　3）發(fā)現(xiàn)并初步闡述了細胞外Gal3C抑制細胞生長和轉移的機制，細胞外Gal3C能夠調控與HepG2轉移相關的靶基因，NDRG1、CLU、ALCAM、MVP、S100A11以及Galectin-1的表達，并發(fā)現(xiàn)NDRG1對抗腫瘤藥物達沙替尼的敏感度很高；
　　4）發(fā)現(xiàn)了一組未經報道過的Galectin-3在HCC細胞表面的潛在受體群。
　　本論文的研究結論使我們獲得了Gal3C調控HC

19、C生長和轉移機制的較為清晰的認識。細胞外Gal3C能夠結合到HepG2細胞表面，從而抑制HCC的生長和轉移。Gal3C對HepG2的生長和轉移的調控機制可能包括：1）直接影響細胞表面的粘附分子如ALCAM的表達；2）抑制細胞內的能量代謝水平；3）調控細胞內與生長和轉移的相關基因，如 NDRG1、S100A11等的表達。
　　Gal3C對 HCC的調控是多方向，其詳細機制仍然具有深入研究的價值。本論文僅從生物學和蛋白質組學角度，對其