微囊藻毒素—LR對(duì)中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞的氧化應(yīng)激和凋亡作用.pdf

1、微囊藻毒素(Microcystins,MCs)是由藍(lán)藻細(xì)菌產(chǎn)生的一類單環(huán)7肽生物毒素,已發(fā)現(xiàn)80多種異構(gòu)體,其中最常見(jiàn)、研究較深入的是微囊藻毒素-LR(MC-LR)。MCs可通過(guò)食物鏈及飲水進(jìn)入人體,嚴(yán)重威脅人類的生命和健康。性腺是MCs的第2靶器官,有研究證明MCs具有生殖毒性。但是,目前關(guān)于MCs誘導(dǎo)生殖系統(tǒng)尤其是雌性生殖系統(tǒng)損傷方面的資料還不多,其致毒機(jī)制也不確定。而有研究發(fā)現(xiàn)MC-LR可以在卵中大量存在并傳遞至后代,而且MC-L

2、R具有環(huán)境內(nèi)分泌干擾作用,能對(duì)魚(yú)類和哺乳動(dòng)物細(xì)胞發(fā)揮雌激素樣作用。因此,研究MC-LR對(duì)雌性生殖系統(tǒng)的毒性作用具有重要意義。
　　 本研究以中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞為模型,經(jīng)MC-LR暴露后,檢測(cè)CHO細(xì)胞活性的變化,及細(xì)胞內(nèi)活性氧、抗氧化酶、脂質(zhì)過(guò)氧化水平,線粒體膜電位,天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)活性和細(xì)胞凋亡率的變化,從分子水平探討MC-LR對(duì)CHO細(xì)胞的毒性作用,為闡明MC-LR的生殖毒性作用

3、提供理論基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1.建立傳代培養(yǎng)的CHO細(xì)胞模型。
　　 2.用四甲基偶氮唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)比色法檢測(cè)MC-LR對(duì)CHO細(xì)胞活性的影響:不同濃度的MC-LR(0μg/ml,1μg/ml,5μmg/ml,10μg/ml,15μg/ml)處理CHO細(xì)胞24h后,用MTT染色,測(cè)各組吸光度,計(jì)算細(xì)胞活性。
　　 3.集落形成實(shí)驗(yàn):用不同濃

4、度的MC-LR(0μg/ml,2.5μg/ml,5μg/ml,10μg/ml)處理CHO細(xì)胞24h,計(jì)算各組集落形成能力,評(píng)價(jià)MC-LR對(duì)單個(gè)CHO細(xì)胞增殖能力的影響。
　　 4.檢測(cè)MC-LR對(duì)CHO細(xì)胞中過(guò)氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)的影響:用不同濃度的MC-LR(0μg/ml,2.5μg/ml,5μg/ml,10μg/ml)處理CHO細(xì)胞,24h后收集細(xì)胞,用2,7-二氯熒光乙酰乙酸鹽(DCFH-

5、DA)法測(cè)定ROS,硫代巴比妥酸(TBA)法測(cè)定MDA,可見(jiàn)分光光度法測(cè)定CAT。
　　 5.線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒檢測(cè)不同劑量MC-LR(0μg/ml,2.5μg/ml,5μg/ml,10μg/ml)染毒24h后CHO細(xì)胞線粒體膜電位的變化。
　　 6.Caspase-3底物切除法檢測(cè)MC-LR(0μg/ml,2.5μg/ml,5μg/ml,10μg/ml)對(duì)CHO細(xì)胞中caspase-3活性的影響。
　　 7

6、.膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)雙染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度的MC-LR(0μg/ml,2.5μg/ml,5μg/ml,10μg/ml)染毒24h后細(xì)胞凋亡率的變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.MC-LR(0μg/ml,1μg/ml,5μg/ml,10μg/ml,15μg/ml)處理CHO細(xì)胞24h后,MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示隨著毒素濃度升高,細(xì)胞形態(tài)逐漸改變,細(xì)胞活性逐漸降低。

7、且與對(duì)照組相比,5μg/ml、10μg/ml和15μg/ml染毒組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。集落形成實(shí)驗(yàn)中隨著染毒濃度增加,集落形成能力下降,與上述結(jié)果一致,也證明MC-LR能抑制CHO細(xì)胞活性。
　　 2.本次研究發(fā)現(xiàn),MC-LR(0μg/ml,2.5μg/ml,5μg/ml,10μg/ml)作用于CHO細(xì)胞24h后,各染毒組的細(xì)胞內(nèi)CAT水平降低,ROS產(chǎn)生和脂質(zhì)過(guò)氧化升高。與對(duì)照組相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0

8、.05)。
　　 3.MC-LR(0μg/ml,2.5μg/ml,5μg/ml,10μg/ml)處理CHO細(xì)胞24h后,用線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒檢測(cè)線粒體膜電位,結(jié)果顯示隨著毒素濃度升高,線粒體膜電位降低,存在劑量依賴關(guān)系。與對(duì)照組相比,各染毒組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 4.隨著染毒濃度增大,細(xì)胞中caspase-3活性劑量依賴性增強(qiáng)。且與對(duì)照組相比,各濃度MC-LR染毒組的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.

9、05)。
　　 5.流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn),MC-LR(0μg/ml,2.5μg/ml,5μg/ml,10μg/ml)處理CHO細(xì)胞24h后,各染毒組細(xì)胞凋亡率隨著毒素濃度的升高而升高,且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.暴露于MC-LR能誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的CHO細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激。
　　 2.誘導(dǎo)氧化損傷后,MC-LR導(dǎo)致進(jìn)一步的毒性作用,抑制CHO細(xì)胞活性,并可能通過(guò)線粒體凋亡通路誘