微囊藻毒素-LR誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞凋亡及其機(jī)制研究.pdf

1、MCs是藍(lán)藻生長過程中釋放的代謝產(chǎn)物，是一組具有生物活性的單環(huán)七肽化合物，是對人類及動(dòng)物健康威脅最大的一種細(xì)胞內(nèi)毒素。MCs性質(zhì)穩(wěn)定，常規(guī)飲用水物理及化學(xué)凈化處理措施很難將其有效清除。藻毒素從破裂的藻細(xì)胞中釋放到水體中，可經(jīng)過口腔攝入、肺部呼吸、皮膚接觸以及血液滲透等不同的途徑給人類及動(dòng)物健康造成威脅。有文獻(xiàn)報(bào)道藍(lán)藻毒素可能會(huì)由于水體泡沫以及娛樂過程中產(chǎn)生的浪花等通過肺部呼吸進(jìn)入到人體，從而可能會(huì)引起呼吸系統(tǒng)疾病。
　　目的：

2、r>　　本實(shí)驗(yàn)通過建立穩(wěn)定的微囊藻毒素-LR(Microcystins-LR,MC-LR)染毒人支氣管上皮(HumanBronchialEpithelial，16HBE)細(xì)胞研究模型，觀察MC-LR對16HBE細(xì)胞的毒性凋亡作用及凋亡相關(guān)蛋白、線粒體途徑相關(guān)分子表達(dá)的影響，旨在闡明MC-LR誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞的凋亡作用及其可能機(jī)制。
　　方法：
　　1.人支氣管上皮細(xì)胞活性的測定采用MTT法檢測MC-LR對16HBE細(xì)胞活性

3、的影響，并找出半數(shù)有效濃度(EC50)，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇毒素濃度提供依據(jù)。
　　2.活性氧測定采用2，7-二氯熒光乙酰乙酸鹽(DCFH-DA)法測定16HBE細(xì)胞中ROS含量。
　　3.線粒體膜電位測定JC-1染色法結(jié)合流式細(xì)胞儀測定熒光強(qiáng)度。
　　4.細(xì)胞凋亡率的測定膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(AnnexinV-FITC/PI)雙染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測。
　　5.Caspase抑制劑(z-Val-Ala

4、-Asp(O-methyl)-fluoromethylketone,Z-VAD-FMK)以及Z-VAD-FMK和MC-LR聯(lián)合暴露分別對16HBE細(xì)胞活性影響的測定MTT方法檢測活性并找出在后續(xù)試驗(yàn)中Z-VAD-FMK的濃度。
　　6.Westernblot檢測Caspase-3，Caspase-9，Cyt-c，Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)量。
　　結(jié)果：
　　1.MC-LR(0，1，10，20，30及40μg/ml)處

5、理16HBE細(xì)胞24h后，結(jié)果顯示隨著MC-LR濃度的升高，16HBE細(xì)胞的活性逐漸降低。且1，10，20，30及40μg/ml染毒組細(xì)胞活性與對照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。
　　2.當(dāng)暴露時(shí)間一定時(shí)，隨著MC-LR濃度的升高，16HBE細(xì)胞內(nèi)ROS的含量呈上升趨勢。當(dāng)MC-LR濃度分別為5，10μg/ml時(shí)，ROS含量隨著暴露時(shí)間的增加而增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　3.當(dāng)MC-LR濃度為

6、10μg/ml時(shí)，不管作用于細(xì)胞24h或48h時(shí)，與對照組相比，線粒體膜電位均呈下降趨勢;且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　4.MC-LR(2.5，5，10μg/ml)處理16HBE細(xì)胞24h后，細(xì)胞凋亡率分別為6.03％、17.90％、26.10％。當(dāng)暴露48h后，細(xì)胞凋亡率分別為19.40％、23.80％、32.23％。
　　5.Caspase抑制劑單獨(dú)作用時(shí)，與對照組相比，當(dāng)Z-VAD-FMK濃度大于100μ

7、M時(shí)，細(xì)胞活性均降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。當(dāng)抑制劑與毒素聯(lián)合作用時(shí)，當(dāng)MC-LR濃度分別為5，10μg/ml，加入的Z-VAD-FMK濃度為10μg/ml時(shí)，與未加Z-VAD-FMK組相比，細(xì)胞活性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　6.Westernblot結(jié)果顯示:暴露于MC-LR24h后，與對照相比，Caspase-3，Caspase-9，Cyt-c及Bax相對表達(dá)量升高，而Bcl-2的相對表達(dá)量降

8、低，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。MC-LR作用于16HBE細(xì)胞48h時(shí)，各目的蛋白相對表達(dá)量的變化趨勢與MC-LR作用24h基本一致。MC-LR暴露于16HBE細(xì)胞相同濃度時(shí)，Bcl-2相對表達(dá)量隨暴露時(shí)間的增加而降低，其余各蛋白相對表達(dá)量增加，具有時(shí)間依賴關(guān)系。
　　7.加入caspase抑制劑Z-VAD-FMK預(yù)處理后，與不加組相比，細(xì)胞凋亡率明顯減少，Caspase-3和Caspase-9的蛋白相對表達(dá)量降低，且差