轉(zhuǎn)染人熱休克蛋白70對同種異體移植心臟移植物血管病的影響.pdf

1、第一部分人熱休克蛋白70腺病毒載體的構(gòu)建 目的:構(gòu)建人熱休克蛋白70(HSP70)重組腺病毒(AD)載體(AD5-HSP70)。 方法: 通過質(zhì)粒提取、測序鑒定HSP70，利用細(xì)菌內(nèi)質(zhì)粒間同源重組法構(gòu)建AD5-HSP70。 結(jié)果: 成功獲取HSP70后，利用細(xì)菌內(nèi)質(zhì)粒間同源重組法成功復(fù)制缺陷重組腺病毒載體AD5-HSP70。 結(jié)論: 本研究證實(shí)利用細(xì)菌內(nèi)同源重組法成功構(gòu)建腺病毒載

2、體AD5-HSP70并通過測序，為進(jìn)一步研究HSP70的基因治療奠定了基礎(chǔ)。 第二部分改良Heron法建立頸部異位心臟移植模型 目的： 對Heron法進(jìn)行部分改進(jìn)，建立簡化的wistar-SD大鼠頸部異位心臟移植模型。 方法： 采用改進(jìn)的套管技術(shù)通過自制Cuff管將wistar大鼠供心的升主動脈、肺動脈與SD大鼠受體的右側(cè)頸總動脈、頸外靜脈分別進(jìn)行吻合連接。 結(jié)果： 單人操作連續(xù)進(jìn)

3、行正式試驗(yàn)24例，成功率100％，無吻合口漏血或血管回流受阻，移植物復(fù)跳率100％?？偸中g(shù)時間45～60min，吻合時間3～5min，供心冷缺血平均15min。 結(jié)論： 改良Heron法建立大鼠頸部異種心臟移植無需顯微外科操作，是一種簡便、經(jīng)濟(jì)實(shí)用、穩(wěn)定可靠和易于復(fù)制的器官移植研究動物模型。 第三部分轉(zhuǎn)染人熱休克蛋白70對同種異體移植心臟移植物血管病的影響 目的： 建立頸部心臟移植模型，研究經(jīng)冠狀

4、動脈內(nèi)灌注重組腺病毒載體介導(dǎo)HSP70(Ad.HSP70)轉(zhuǎn)基因治療對同種異體心臟移植物血管病的影響，并探討同種移植的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)。 方法： 以套管技術(shù)建立頸部異位異種心臟移植模型，wistar大鼠供心切取后，基因轉(zhuǎn)移組在體外經(jīng)冠狀動脈緩慢灌注含3.8 × 10VP/mL Ad-HSP70的4℃HTK液，持續(xù)45min，再植入SD大鼠受體頸部(3組)?？瞻纵d體組灌注含3.8×1010VP/mL不攜帶的基因腺病毒空白載體(

5、Ad)的HTK液(2組)，對照組僅灌注無病毒的HTK液(1組)持續(xù)同樣時間。術(shù)后1月收集移植物組織作檢測。組織內(nèi)目的基因表達(dá)產(chǎn)物通過免疫分析、RT-PCR進(jìn)行半定量分析，免疫組化染色進(jìn)行定性和定位分析。 結(jié)果： RT-PCR證實(shí)移植物內(nèi)外源性HSP70基因轉(zhuǎn)錄，免疫組化檢測證實(shí)Ad.HSP70轉(zhuǎn)染的移植物(3組)HSP70成功轉(zhuǎn)到血管周圍的心肌細(xì)胞和冠狀動脈微血管，HSP70表達(dá)水平明顯高于其他兩組(P<0.01)。HS

6、P70過量表達(dá)能夠增加BCL-2表達(dá)及減少NF-K B的活化以及VCAM-1的表達(dá)，HSP70過量表達(dá)的移植物內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤數(shù)明顯減少，巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞浸潤減少，移植物血管內(nèi)皮損傷輕。 結(jié)論： 本研究證實(shí)，經(jīng)冠狀動脈灌注重組腺病毒載體介導(dǎo)保護(hù)性自穩(wěn)蛋白一人熱休克蛋白70基因轉(zhuǎn)移到心臟移植物是相當(dāng)有效可行的，并減輕移植物冠脈內(nèi)皮損傷，預(yù)防移植物血管病。經(jīng)冠狀動脈灌注重組腺病毒載體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移在移植物內(nèi)局部表達(dá)有潛力的治療