轉(zhuǎn)染人熱休克蛋白70基因（hHSP70）對(duì)大鼠同種異體移植肺缺血再灌注的影響.pdf

1、目的： 1、構(gòu)建熱休克蛋白70基因(HSP 70)重組5型腺病毒載體，為研究HSP 70的基因治療奠定基礎(chǔ)。 2、采用“兩袖套一支架管”法建立大鼠的左肺原位移植動(dòng)物模型，為研究肺移植再灌注損傷提供較為穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。利用HSP 70內(nèi)源性細(xì)胞保護(hù)的生物學(xué)特性，以大鼠同種異體左肺原位移植為動(dòng)物模型，以人HSP 70為目的基因，復(fù)制缺陷的5型重組腺病毒載體為介導(dǎo)，通過離體肺的肺靜脈灌注，誘導(dǎo)體內(nèi)高表達(dá)HSP 70，觀察其對(duì)大

2、鼠移植肺IRI的影響。 方法： 1、利用基因重組技術(shù)，構(gòu)建hHSP70轉(zhuǎn)基因載體，制備、包裝腺病毒。 2、應(yīng)用改良的“兩袖套一支架管”法，通過對(duì)套管的制作、供肺的灌注和獲取及套接技術(shù)等方面進(jìn)行改進(jìn)，單人肉眼直視下完成供受體肺動(dòng)脈、肺靜脈和支氣管的吻合。 3、以SD大鼠為供受體，改良的“兩袖套一支架管”法建立大鼠的左肺原位移植動(dòng)物模型，實(shí)驗(yàn)分LPDG保存液對(duì)照組、空白載體組和hHSP70基因轉(zhuǎn)染組，分別灌注

3、10℃加入肝素的LPD-glucose液、單純腺病毒載體和hHSP70基因重組腺病毒載體(5×109PFU)，然后在10℃LPD-glucose液中保存3小時(shí)后移入受體，另設(shè)假手術(shù)對(duì)照組。移植肺再灌注后4h，檢測(cè)以下指標(biāo)：血?dú)夥治?；?濕重比率；移植肺組織中MDA含量、SOD和MPO的活性；病理組織學(xué)檢查；hHSP70、FNF-α、IFN-γ、IL-6、NF-B、Bax、Bc1-2的表達(dá)情況；細(xì)胞凋亡檢測(cè)。 結(jié)果： 1、

4、成功構(gòu)建了HSP 70基因重組5型腺病毒載體。 2、連續(xù)進(jìn)行大鼠左肺原位移植20例，手術(shù)成功率85％，平均總手術(shù)操作時(shí)間65±10 min，病理組織學(xué)檢查證實(shí)移植肺再灌注后4h成功復(fù)制了典型的肺IRI。 3、基因轉(zhuǎn)染組再灌注后4h，RT-PCR、免疫組化染色證實(shí)移植肺成功表達(dá)特異性的hHSP70基因產(chǎn)物。與對(duì)照組比較，PaO2明顯上升，W/D降低，差別有顯著意義(P<0.05)； MDA含量和MPO活性明顯下降，

5、SOD活性明顯升高(P<0.05)；TNF-α、IFN-γ、IL-6、NF-κB和Bax的表達(dá)水平下降(P<0.05)；Bc1-2表達(dá)水平升高(P<0.05)。光鏡觀察轉(zhuǎn)染組肺泡間質(zhì)水腫減輕，炎癥細(xì)胞侵潤(rùn)減少，細(xì)胞凋亡減少。 結(jié)論： 1、成功構(gòu)建攜帶hHSP70基因的重組腺病毒載體能在239細(xì)胞系中包裝成具有感染性的重組腺病毒。病毒顆粒滴度高、純度好，重組腺病毒感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞后能表達(dá)目的蛋白，為重組腺病毒應(yīng)用研究奠定基

6、礎(chǔ)。 2、應(yīng)用改良的“兩袖套一支架管”法，通過技術(shù)改進(jìn)，成功建立大鼠左肺原位移植動(dòng)物模型。手術(shù)由單人肉眼直視下完成，能基本模擬臨床的肺移植過程，適合研究肺的IRI。 3、離體供肺經(jīng)肺靜脈灌注轉(zhuǎn)染外源性目的基因切實(shí)有效。 4、腺病毒載體介導(dǎo)hHSP 70轉(zhuǎn)基因治療通過抑制TNF-α、IFN-γ和IL-6等炎性細(xì)胞因子，減輕過氧化作用，有效地抑制移植肺的IRI。5、HSP70轉(zhuǎn)基因治療使bax/bc1-2比值減少，起