同種異體移植的MHCII基因沉默BMSCs對(duì)AMI大鼠心臟影響的研究.pdf

1、目的：
　　研究表明，免疫原性改變可能是BMSCs（骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞）同種異體移植后存活率低的原因之一，本課題設(shè)計(jì)低免疫原性BMSCs，觀察其是否能提高BMSCs移植后存活率,改善心臟心梗后狀態(tài)，為干細(xì)胞的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。
　　方法：
　　1.復(fù)蘇所購(gòu)的從大鼠骨髓中提取的BMSCs，進(jìn)行細(xì)胞體外培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)到70％-80%時(shí)，用0.25%胰酶消化，傳代，調(diào)整細(xì)胞狀態(tài)，保持較好的細(xì)胞活性，為后期的慢病毒感染作準(zhǔn)備

2、。
　　2.取5代細(xì)胞，不同濃度嘌呤霉素共培養(yǎng)72h后，利用CCk-8測(cè)吸光值OD，選取細(xì)胞剛好全部死亡的最小嘌呤霉素濃度作為最佳的篩選濃度。
　　3.將所設(shè)計(jì)的慢病毒以MOI=5、20、50、100感染BMSCs，在感染后72h，用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞熒光表達(dá)情況，檢測(cè)感染效率，篩選獲得最佳感染效率的MOI值。
　　4.選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的BMSCs，以最佳感染效率的MOI感染BMSCs，72h后加入嘌呤霉素篩選一周，獲

3、取穩(wěn)定的細(xì)胞株。在所得穩(wěn)定遺傳細(xì)胞株以及BMSCs中加入IFN-γ刺激，作用24h后提取細(xì)胞，RT-QPCR以及western blotting證實(shí)MHCII基因的沉默。
　　5.建立大鼠心肌梗死模型，結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈前降支，1周后在心梗邊緣區(qū)進(jìn)行細(xì)胞移植。實(shí)驗(yàn)分為4組，假手術(shù)組：冠脈僅穿線不結(jié)扎，AMI組，單純結(jié)扎冠脈，BMSCs組，移植BMSCs細(xì)胞，MHCII組，移植MHCII基因沉默的BMSCs。
　　6.4周后行大

4、鼠心臟彩超，測(cè)定大鼠心功能的改善情況；取心肌梗死組織，利用RT-QPCR技術(shù)，測(cè)定SRY基因的表達(dá)，間接推測(cè)BMSCs移植后的存活率；心臟組織病理切片，做HE, Msson染色，VEGF，F(xiàn)4/80的免疫組化，評(píng)價(jià)纖維化，血管的新生情況，巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)情況。
　　7.最終數(shù)據(jù)處理均采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)分析，均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析，P＜0.05提示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

5、義。
　　結(jié)果：
　　1.BMSCs形態(tài)多為長(zhǎng)梭形，少數(shù)呈多角形，成功獲取了BMSCs
　　2.慢病毒感染BMSCs，24h未見明顯的熒光蛋白表達(dá)，48h方可見熒光蛋白表達(dá)，72h熒光表達(dá)達(dá)到高峰。MOI=5,20時(shí)可見熒光蛋白表達(dá)，但轉(zhuǎn)染陽(yáng)性率較低，MOI=50,100時(shí)，可見明顯的熒光蛋白表達(dá)。慢病毒轉(zhuǎn)染時(shí)，細(xì)胞狀態(tài)稍差，綜合感染陽(yáng)性率和病毒對(duì)細(xì)胞的影響，選擇MOI=50作為最佳的感染病毒滴度。
　　3.用嘌

6、呤霉素做穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選，當(dāng)嘌呤霉素濃度為0,2,2.5μg/ml時(shí)，BMSCs未完全死亡，隨著嘌呤霉素濃度不斷升高，嘌呤霉素為3,3.5,4,4.5,5μg/ml時(shí)細(xì)胞完全死亡，且各組之間無(wú)明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；3.0μg/ml為細(xì)胞恰好完全死亡的最低濃度，故選擇3.0μg/ml作為最佳的篩選濃度。
　　4，篩選后的慢病毒感染BMSCs細(xì)胞，IFN-γ刺激下，MHCII基因的mRNA表達(dá)，基因沉默組低于未沉默組（P＜0.05），蛋白

7、表達(dá)結(jié)果趨勢(shì)同RT-QPCR，MHCII基因沉默組低于未沉默組（P＜0.05）。
　　5.構(gòu)建大鼠心肌梗死模型，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支后，結(jié)扎區(qū)域以下心肌變白，與非梗死區(qū)交界清晰，室壁運(yùn)動(dòng)減弱，心率增快。
　　6.心梗模型4周后，心臟彩超結(jié)果顯示，干細(xì)胞移植組較單純心梗組大鼠心功能有一定的改善，且MHCII基因沉默組心功能改善更為明顯。
　　7.SRY基因的RT-QPCR結(jié)果：MHCII基因沉默組SRY較單純BMSCs移植

8、組SRY mRNA表達(dá)增高，MHCII基因沉默可能提高BMSCs移植的存活率。
　　8.心臟組織病理結(jié)果：HE及Masson染色結(jié)果顯示，心肌正常組織破壞。VEGF，F(xiàn)4/80結(jié)果：心梗區(qū)域，血管新生的情況及巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)程度，MHCII基因沉默組較 BMSCs移植組改善更為明顯。心肌梗死區(qū)域的心肌組織出現(xiàn)纖維化，結(jié)締組織增生，組織變薄，變軟，凹陷。
　　結(jié)論：
　　1.減低免疫原性能提高BMSCs的存活率。