博爾納病病毒磷蛋白的原核表達(dá)和p24片段熒光定量PCR試劑盒的研制開(kāi)發(fā).pdf

1、背景及目的:
　　 博爾納病病毒(BDV)是一種嗜神經(jīng)性的單股負(fù)鏈RNA病毒,BDV的感染宿主包括了大部分溫血?jiǎng)游?而根據(jù)一些研究認(rèn)為BDV感染也可能于人類精神疾病有關(guān),在我國(guó)和其他國(guó)家一些地區(qū)動(dòng)物、精神疾病患者和腦炎患者中均有散在BDV疑似陽(yáng)性病例報(bào)導(dǎo)。BDV基因組含有6個(gè)開(kāi)放式讀碼框(ORF),其中ORFⅡ編碼磷蛋白(p24),磷蛋白作為抗原參與血清免疫反應(yīng)可以檢測(cè)判斷是否有病毒感染存在。此外p24基因由于序列高度保守,并且

2、在檢測(cè)同等病毒量時(shí)其敏感性要高于核蛋白基因,故p24片段是在BDV核酸檢測(cè)上的主要指標(biāo)。
　　 本研究通過(guò)原核表達(dá)出磷蛋白,并對(duì)其進(jìn)行純化和鑒定,以進(jìn)一步制備抗體和開(kāi)發(fā)相關(guān)免疫學(xué)檢測(cè)試劑盒。另一方面在套式熒光定量PCR基礎(chǔ)上優(yōu)化適合p24擴(kuò)增的PCR緩沖液,同時(shí)摸索最佳反應(yīng)條件,嘗試開(kāi)發(fā)BDV p24片段一步法實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒,使之能達(dá)到穩(wěn)定可靠而更簡(jiǎn)單方便的要求以便可以對(duì)樣本進(jìn)行大規(guī)?？焖俸Y選,通過(guò)流行病學(xué)調(diào)查來(lái)了解該

3、病毒在我國(guó)的分布及流行特征,防治將來(lái)可能出現(xiàn)大規(guī)模的暴發(fā)流行,此外在臨床檢驗(yàn)中可以進(jìn)一步研究分析BDV和人類神經(jīng)精神疾病的相關(guān)性。
　　 方法:
　　 1通過(guò)RT-PCR方法獲得p24基因片段,將目的片段插入到pET-41a原核表達(dá)載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化到BL21大腸桿菌,使用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)并親和層析純化,對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)的磷蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳和Western-Blot分析和鑒定。
　　 2根據(jù)p24片段

4、設(shè)計(jì)合成引物和探針,通過(guò)常規(guī)PCR比較選擇3種常用酸(鹽酸、磷酸和硫酸)所滴定的緩沖液體系,在其基礎(chǔ)上選擇適合濃度的硫酸銨配制TSS buffer,在TSS buffer中分別加入四甲基氯化銨、Triton X-100、二甲亞砜和甜菜堿這4種常用的PCR添加劑,并確定各自的最佳工作濃度,選擇擴(kuò)增效果較好的添加劑與其他添加劑進(jìn)行依次組合,尋找最佳的添加劑組合,最后用熒光定量PCR進(jìn)行對(duì)比驗(yàn)證。此外在引物的退火溫度、引物和探針的最佳濃度、d

5、NTPs和Mg2+的最佳工作濃度上做出相應(yīng)的優(yōu)化,以求試劑盒的擴(kuò)增效率和標(biāo)準(zhǔn)曲線達(dá)到滿意的效果。
　　 結(jié)果:
　　 1成功構(gòu)建pET41a-p24重組質(zhì)粒,經(jīng)酶切鑒定和測(cè)序后證實(shí)序列正確,SDS-PAGE分析目的蛋白表達(dá)量占菌體總蛋白30％以上,并且目的蛋白以可溶形式表達(dá),純化后蛋白純度達(dá)85%左右,對(duì)磷蛋白進(jìn)行Western-Blot鑒定可見(jiàn)可以與p24單克隆抗體特異性結(jié)合。
　　 2在滴定酸上選擇了效果最好

6、的硫酸,配制TSS buffer硫酸銨的最佳終濃度為6mmol/L。在添加劑的優(yōu)化組合上,1.5mol/L甜菜堿、0.15%Triton X-100、8mmol/L四甲基氯化銨和TSS buffer組合成的TBTT buffer效果最佳,在其與Takara的熱啟動(dòng)PCR buffer的對(duì)比中,TBTT buffer在擴(kuò)增效率和標(biāo)準(zhǔn)曲線上明顯好于后者,此外退火溫度、dNTPs、Mg2+、引物和探針的最佳工作濃度也得以確定。