大腸桿菌和沙門氏菌定量檢測方法的建立和試劑盒的研制.pdf

1、土壤是人類賴以生存和發(fā)展的基礎(chǔ),承擔(dān)著來自環(huán)境中大約90％的污染物,目前人們對土壤質(zhì)量的要求主要集中于農(nóng)藥殘留,重金屬污染和有機(jī)污染,對于土壤中病原微生物的研究關(guān)注不多。土壤中的病原微生物可以通過多種暴露途徑與人體接觸,從而危害人體健康。大腸桿菌和沙門氏菌是土壤中兩類重要的病原微生物,但目前國內(nèi)檢測病原微生物主要采用傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)方法,其操作耗時(shí)耗力,往往需要5-6天才能完成,而且靈敏度比較低,假陽性數(shù)量較多。近幾年,隨著免疫學(xué)和分子生

2、物學(xué)的發(fā)展,基于新技術(shù)的病原微生物檢測方法也被建立起來,尤其是國外,已有部分快速檢測試劑盒產(chǎn)品問世,而國內(nèi)相關(guān)研究相對滯后。
　　 為建立一種有效的病原微生物定量檢測方法,本研究采用MPN-PCR的方法來定量檢測土壤中的病原微生物。該方法的關(guān)鍵思路在于利用了PCR方法快速準(zhǔn)確的優(yōu)勢,取代了傳統(tǒng)MPN方法中陽性結(jié)果的生化鑒定和血清學(xué)鑒定等步驟,從而減少了傳統(tǒng)方法中的繁瑣步驟,提高了檢測效率。針對大腸桿菌和沙門氏菌的特異性基因分別設(shè)

3、計(jì)了兩對特異性引物,優(yōu)化了PCR反應(yīng)模板的制備,建立了一種定量檢測病原微生物的方法,并對該方法的靈敏度進(jìn)行了評估,最后,在該方法的基礎(chǔ)上開發(fā)了定量檢測試劑盒。最終結(jié)果如下:
　　 1、分別以大腸桿菌和沙門氏菌作為研究對象,對同一樣品進(jìn)行了MPN計(jì)數(shù)與平板菌落計(jì)數(shù)并對計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行回歸分析,建立了兩者對數(shù)值之間的定量關(guān)系。大腸桿菌MPN計(jì)數(shù)與平板菌落計(jì)數(shù)回歸方程為y=0.9566x,R2=0.9941;沙門氏菌MPN計(jì)數(shù)與平板菌落計(jì)

4、數(shù)回歸方程為v=1.0144x,R2=0.9957。對兩者回歸系數(shù)進(jìn)行方差分析顯示極顯著。使MPN計(jì)數(shù)法具有與平板菌落計(jì)數(shù)法一樣的準(zhǔn)確性,從而為病原微生物,甚至功能微生物的定量計(jì)數(shù)提供更為準(zhǔn)確的結(jié)果。
　　 2、根據(jù)沙門氏菌的invA基因序列,采用沙門氏菌用的特異性引物invA-1和invA-2,引物擴(kuò)增片段為284bp;根據(jù)大腸桿菌phoA基因序列,采用引物設(shè)計(jì)軟件Primer5.0進(jìn)行設(shè)計(jì)引物,引物擴(kuò)增片段為684bp。同時(shí)

5、對三種PCR反應(yīng)模板制備方法進(jìn)行了比較,選用熱裂解法作為PCR反應(yīng)模板制備方法。利用滅菌土壤中添加純茵實(shí)驗(yàn)評估了定量檢測方法的靈敏度:大腸桿菌定量檢測方法的靈敏度為25個(gè)/g土壤,沙門氏菌定量檢測方法的靈敏度為250個(gè)/g土壤。
　　 3、在建立定量檢測方法的基礎(chǔ)上,成功研制MPN-PCR定量檢測試劑盒,并對其進(jìn)行了靈敏度和保存期的評估:大腸桿菌定量檢測方法的靈敏度為25個(gè)/g土壤,沙門氏菌定量檢測方法的靈敏度為250個(gè)/g土壤