豬圓環(huán)病毒II型熒光定量PCR檢測方法的建立及Rep和Cap蛋白的原核表達.pdf

1、豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus)屬于圓環(huán)病毒科，圓環(huán)病毒屬。是一種小的，無囊膜的單鏈負股環(huán)狀DNA病毒。病毒分為PCV1和PCV2兩種，其中PCV1無致病性，PCV2對豬具有致病性，與近年來世界各國普遍發(fā)生的斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)密切相關，該病主要以進行性消瘦和多系統(tǒng)病理損傷為特征，而且PCV2的感染可引起免疫抑制，容易

2、繼發(fā)或并發(fā)其他疾病，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了極大的經(jīng)濟損失。我國是養(yǎng)豬大國，對該病及其病原進行研究具有重要的意義。本文主要內容及結果如下:
　　 根據(jù)Genbank發(fā)表的PCV2序列設計特異性引物，擴增ORF3基因和ORF3基因中196bp特異片段，將ORF3基因克隆到pMD-18T載體中，以10倍梯度稀釋后的純化質粒作為標準品，進行熒光定量PCR，繪制標準曲線，建立了豬圓環(huán)病毒Ⅱ型的SYBRGreenⅠ熒光定量PCR檢測方法。結果表

3、明，該方法能特異性檢測PCV2，與其它豬源病毒無交叉反應，敏感性達到10個拷貝，是普通PCR的100倍，重復性試驗變異系數(shù)均小于5％。臨床應用表明，該方法可快速，準確地檢測PCV2。實驗數(shù)據(jù)證實，該方法具有良好的特異性、敏感性和重復性。從而為豬圓環(huán)病毒定量檢測提供了科學的方法。
　　 根據(jù)GenBank中已發(fā)表的豬圓環(huán)病毒Ⅱ型全基因組序列，設計兩對引物，從本實驗室構建的PCV2雙拷貝DNA感染性克隆中擴增出豬圓環(huán)病毒Ⅱ型ORF1

4、基因和ORF2截短基因，擴增的DNA片段分別約為962bp、580bp，與預期片段大小相同。將擴增的基因片段分別克隆到pQE30原核表達載體中，獲得重組質粒pQE30-ORF1、pQE30-ORF2。重組細菌裂解物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和Western-blot檢測分析，含有重組質粒pQE30-ORF1、pQE30-ORF2的大腸桿菌M15均能夠表達分子量約為40 kDa和27 kDa的融合蛋白，為蛋白功能研究和單克隆