豬圓環(huán)病毒II型熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立及Rep和Cap蛋白的原核表達(dá).pdf

1、豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus)屬于圓環(huán)病毒科，圓環(huán)病毒屬。是一種小的，無(wú)囊膜的單鏈負(fù)股環(huán)狀DNA病毒。病毒分為PCV1和PCV2兩種，其中PCV1無(wú)致病性，PCV2對(duì)豬具有致病性，與近年來(lái)世界各國(guó)普遍發(fā)生的斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)密切相關(guān)，該病主要以進(jìn)行性消瘦和多系統(tǒng)病理?yè)p傷為特征，而且PCV2的感染可引起免疫抑制，容易

2、繼發(fā)或并發(fā)其他疾病，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失。我國(guó)是養(yǎng)豬大國(guó)，對(duì)該病及其病原進(jìn)行研究具有重要的意義。本文主要內(nèi)容及結(jié)果如下:
　　 根據(jù)Genbank發(fā)表的PCV2序列設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增ORF3基因和ORF3基因中196bp特異片段，將ORF3基因克隆到pMD-18T載體中，以10倍梯度稀釋后的純化質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行熒光定量PCR，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立了豬圓環(huán)病毒Ⅱ型的SYBRGreenⅠ熒光定量PCR檢測(cè)方法。結(jié)果表

3、明，該方法能特異性檢測(cè)PCV2，與其它豬源病毒無(wú)交叉反應(yīng)，敏感性達(dá)到10個(gè)拷貝，是普通PCR的100倍，重復(fù)性試驗(yàn)變異系數(shù)均小于5％。臨床應(yīng)用表明，該方法可快速，準(zhǔn)確地檢測(cè)PCV2。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)，該方法具有良好的特異性、敏感性和重復(fù)性。從而為豬圓環(huán)病毒定量檢測(cè)提供了科學(xué)的方法。
　　 根據(jù)GenBank中已發(fā)表的豬圓環(huán)病毒Ⅱ型全基因組序列，設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，從本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的PCV2雙拷貝DNA感染性克隆中擴(kuò)增出豬圓環(huán)病毒Ⅱ型ORF1

4、基因和ORF2截短基因，擴(kuò)增的DNA片段分別約為962bp、580bp，與預(yù)期片段大小相同。將擴(kuò)增的基因片段分別克隆到pQE30原核表達(dá)載體中，獲得重組質(zhì)粒pQE30-ORF1、pQE30-ORF2。重組細(xì)菌裂解物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和Western-blot檢測(cè)分析，含有重組質(zhì)粒pQE30-ORF1、pQE30-ORF2的大腸桿菌M15均能夠表達(dá)分子量約為40 kDa和27 kDa的融合蛋白，為蛋白功能研究和單克隆