環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶分子改造、產(chǎn)物特異性及其酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶(CGTase)是一種多功能酶，可以催化多聚糖分子內(nèi)的轉(zhuǎn)糖基作用，即環(huán)化反應(yīng)，也能參與偶合反應(yīng)、水解反應(yīng)、歧化反應(yīng)等分子間的轉(zhuǎn)糖基作用。通過環(huán)化反應(yīng)催化淀粉及相關(guān)基質(zhì)生成環(huán)糊精是其產(chǎn)業(yè)應(yīng)用的基礎(chǔ)，最常見的是生產(chǎn)α-、β-、γ-環(huán)糊精。環(huán)糊精具有外部親水內(nèi)腔疏水的特點(diǎn)，能夠包含客體分子從而改變其物理化學(xué)性質(zhì)，如增加溶解性和穩(wěn)定性，在食品、化妝品、醫(yī)藥、環(huán)境保護(hù)等方面具有重要作用。而作為生產(chǎn)環(huán)糊精的關(guān)鍵酶，CGTase越來越

2、引起人們的重視。
　　目前已有的CGTase催化產(chǎn)物都是α-、β-、γ-環(huán)糊精的混合物，較差的產(chǎn)物特異性對(duì)單一環(huán)糊精的產(chǎn)率及后續(xù)純化分離造成不利影響。因此，借助基因工程手段對(duì)CGTase進(jìn)行定點(diǎn)突變改善CGTase的產(chǎn)物特異性成為重要研究方向之一。針對(duì)上述問題，本文以前期構(gòu)建的含有重組質(zhì)粒pET22b/cgt為基礎(chǔ)，對(duì)CGTase關(guān)鍵氨基酸序列進(jìn)行飽和突變，分析氨基酸與CGTase產(chǎn)物特異性之間的內(nèi)在聯(lián)系，主要結(jié)果如下:
　

3、　通過多重序列對(duì)比及相關(guān)文獻(xiàn)分析，發(fā)現(xiàn)來源于蠟狀芽孢桿菌的CGTase43位氨基酸對(duì)CGTase產(chǎn)物特異性具有重要作用。實(shí)驗(yàn)中以構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET22b/cgt為模板，采用全質(zhì)粒的突變方法對(duì)43位組氨酸進(jìn)行飽和突變，將酶解過后的PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)進(jìn)大腸桿菌DMT中，在含有100μg/mL的LB平板篩選得到陽性克隆菌株，成功構(gòu)建突變株H43P、H43Q、H43L、H43I、H43F、H43K、H43A、H43C、H43Y、H43E、H43N、

4、H43R、H43S、H43T、 H43G、 H43M、 H43W;
　　以1CXK作為模板，采用同源建模的方式構(gòu)建了來源于Bacillus cereus的CGTase的空間結(jié)構(gòu)，并用分子動(dòng)力學(xué)軟件對(duì)模建的結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化獲得了可靠的蛋白質(zhì)三維模型。通過與麥芽九糖抑制劑的分子對(duì)接，分析了底物結(jié)合凹槽處的相關(guān)情況，對(duì)-3亞位點(diǎn)及43位氨基酸做出分析;
　　通過定點(diǎn)突變技術(shù)將43位的組氨酸突變成苯丙氨酸(H43F)、酪氨酸(H43Y)

5、和色氨酸(H43W)后，CGTase酶活力從6570 U/mL提高到6667U/mL、7814U/mL、15609U/mL，說明含有芳香環(huán)的氨基酸有利于提升CGTase降解玉米淀粉的能力;大部分氨基酸代替CGTase43位的組氨酸后，β-CD在產(chǎn)物中所占比例減小，而γ-CD比例增加。用殘基側(cè)鏈短的氨基酸代替原有位置的組氨酸，如H43P、H43A、H43G突變酶的催化產(chǎn)物中γ-CD所占比率為30.2％、28.3％、28.1％，其中原始酶組

6、γ-CD占20％;用疏水性強(qiáng)的亮氨酸和異亮氨酸代替組氨酸后，H43I、H43L突變酶催化產(chǎn)物中γ-CD所占比率為28.4％和28.0％;另外H43T突變酶催化產(chǎn)物中γ-CD所占比率為29.2％;
　　對(duì)γ-CD特異性最好的H43P、H43I、H43T突變酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)分析，發(fā)現(xiàn)與原始酶性質(zhì)相似，突變酶的最適溫度為60℃，最適pH為9.0，pH在6.0到9.0區(qū)間內(nèi)保持穩(wěn)定，但是H43P、H43I突變酶的熱穩(wěn)定性比原始酶更好，80℃