24294.軟化類芽孢桿菌α環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶在大腸桿菌中的表達(dá)及其產(chǎn)物特異性分析

1、江南大學(xué)博士學(xué)位論文軟化類芽孢桿菌α環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶在大腸桿菌中的表達(dá)及其產(chǎn)物特異性分析姓名：李兆豐申請學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：發(fā)酵工程指導(dǎo)教師：陳堅(jiān)20090601摘要細(xì)胞膜透性的明顯增加。然而，甘氨酸對(duì)Ecoli細(xì)胞的生長有明顯的負(fù)面影響，這限制了重組酶生產(chǎn)強(qiáng)度的進(jìn)一步提高。Ca2能補(bǔ)償甘氨酸對(duì)細(xì)胞生長的抑制作用，主要體現(xiàn)在單位體積中的細(xì)胞數(shù)和活細(xì)胞數(shù)明顯增加、細(xì)胞自溶明顯減少以及細(xì)胞形態(tài)修復(fù)。當(dāng)TB培養(yǎng)基中同時(shí)添加150mM甘氨酸

2、和20mMCa2，誘導(dǎo)40h后的胞外酶活達(dá)到355U／mL，誘導(dǎo)36h后的最大生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到O90U／mL／h，相比于只添加甘氨酸的情況均提高了50％。4重組ⅨCGT酶在C末端連有6xHistag，因此能用鎳柱進(jìn)行一步親合層析，但該方法純化酶的回收率很低；重組和天然伐CGT酶能通過陰離子交換和疏水色譜兩步純化，純化酶的回收率較高。。aCGT酶在溶液中是單聚體；重組0cCGT酶環(huán)化反應(yīng)的最適溫度為450C，在400C、450C和50。C下的

3、半衰期分別為8h、125h和O5h，而天然酶有稍高的最適溫度(500C)和熱穩(wěn)定性(tl／2，50。c=08h)；重組和天然酶環(huán)化反應(yīng)的最適pH均為55，且分別在pH695和6～10之間相對(duì)穩(wěn)定；僅CGT酶的環(huán)化活力不依賴于金屬輔因子，H92、Ni2、Fe2和C02對(duì)環(huán)化活力有抑制作用，而一些二價(jià)金屬離子能激活環(huán)化活力，特別是Ca2、Ba2和zn2。在酶轉(zhuǎn)化的起始階段，0【CGT酶生產(chǎn)Ⅸ壞糊精作為主要產(chǎn)物，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，p環(huán)糊精的

4、比例明顯增加，最終D環(huán)糊精為主要產(chǎn)物；相比于天然酶，重組酶有更高的僅環(huán)糊精特異性。僅CGT酶環(huán)化反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)適合用Hill方程進(jìn)行描述，Hill常數(shù)高于1暗示酶單聚體的底物結(jié)合有正協(xié)同作用。5。亞位點(diǎn)一3處的Asp372和Tyr89的突變能改變戶maceransCGT酶的環(huán)化活力和環(huán)糊精產(chǎn)物比例，說明這兩個(gè)殘基對(duì)環(huán)糊精產(chǎn)物特異性具有重要作用，也進(jìn)一步證實(shí)亞位點(diǎn)一3對(duì)CGT酶產(chǎn)物特異性來講是關(guān)鍵位點(diǎn)。Asp372突變成賴氨酸和Tyr8

5、9突變成精氨酸顯著提高了PmaceransCGT酶的僅環(huán)糊精特異性，單突變體D372K和Y89R在產(chǎn)物特異性上的改變能累加于雙突變D372KJY89R；相比于野生CGT酶，雙突變體D372K／Y89R的儀環(huán)糊精產(chǎn)量提高了50％，而D環(huán)糊精產(chǎn)量下降了43％。具有更高a一環(huán)糊精特異性的突變體比野生酶更適合于僅環(huán)糊精的工業(yè)化生產(chǎn)。6氨基酸殘基47是定位于亞位點(diǎn)一3附近的主要?dú)埢?，不同類型的CGT酶之間殘基47的氨基酸種類明顯不同，暗示殘基