米曲霉果糖基轉(zhuǎn)移酶AoFT基因的原核和真核表達及酶學性質(zhì)研究.pdf

1、果糖基轉(zhuǎn)移酶具有轉(zhuǎn)糖基作用，是能夠催化果糖基單元從一個蔗糖分子轉(zhuǎn)移到另一個蔗糖的一類酶。三氯蔗糖是人類開發(fā)的一種最完美的強力甜味劑，蔗糖-6-乙酸酯在三氯蔗糖合成中非常重要。生物酶法合成蔗糖-6-乙酸酯成為近年來研宄的熱點，果糖基轉(zhuǎn)移酶可以以蔗糖與葡萄糖-6-乙酸酯為底物，催化合成蔗糖-6-乙酸酯。該方法具有高效性、專一性、且副產(chǎn)物較少等優(yōu)點，因此有極大的應用潛力。
　　在前期試驗中，我們從米曲霉ZZ-01發(fā)酵液的中篩選到一種新型

2、的果糖基轉(zhuǎn)移酶AoFT，并且發(fā)現(xiàn)該酶能夠催化合成蔗糖-6-乙酸酯的。本研宄首先將來自米曲霉中表達果糖基轉(zhuǎn)移酶AoFT的基因在大腸桿菌中表達，然后對大腸桿菌表達的米曲霉果糖基轉(zhuǎn)移酶AoFT的酶學性質(zhì)進行研宄。由于大腸桿菌是胞內(nèi)表達體系，產(chǎn)物分離純化步驟較為復雜，我們又將米曲霉果糖基轉(zhuǎn)移酶AoFT的基因在畢赤酵母中克隆表達，并對畢赤酵母表達的米曲霉果糖基轉(zhuǎn)移酶AoFT酶學性質(zhì)進行研宄，對比分析畢赤酵母與大腸桿菌不同表達系統(tǒng)表達的米曲霉果糖基

3、轉(zhuǎn)移酶AoFT酶學性質(zhì)的差異，通過分析畢赤酵母表達的米曲霉果糖基轉(zhuǎn)移酶AoFT糖基化位點的不同，解釋酶學性質(zhì)變化的原因。
　　具體研宄內(nèi)容如下：
　　(1)通過RACE-PCR的方法，從米曲霉ZZ-01中克隆到果糖基轉(zhuǎn)移酶AoFT基因，并分析果糖基轉(zhuǎn)移酶基因序列的特性。構(gòu)建重組質(zhì)粒pET22b-AoFT，將重組質(zhì)粒pET22b-AoFT轉(zhuǎn)化至E.coli BL21感受態(tài)細胞中構(gòu)建工程菌，利用IPTG誘導，使目的蛋白表達，收集

4、菌體并經(jīng)過超聲破碎、離心和鎳柱親和層析純化等分離純化蛋白，得到目的蛋白，然后進行酶活力的測定。
　　(2)米曲霉果糖基轉(zhuǎn)移酶AoFT的催化特性研究。包括最適反應溫度、最適pH和熱穩(wěn)定性，以及金屬離子、有機溶劑、表面活性劑、還原劑和蛋白抑制劑等對米曲霉果糖基轉(zhuǎn)移酶AoFT活性的影響。
　　(3)將重組質(zhì)粒pET22b-AoFT雙酶切獲得AoFT基因，并與pPICAαA質(zhì)粒構(gòu)成pPICAαA-AoFT重組質(zhì)粒，經(jīng)如Sac I酶切

5、線性化后電轉(zhuǎn)入畢赤酵母X33中，得到X33工程菌，甲醇誘導表達目的蛋白，收集發(fā)酵液并經(jīng)過硫酸銨沉淀和鎳柱親和層析等步驟純化獲得目的蛋白，然后進行酶活力測定。
　　(4)對比分析畢赤酵母與大腸桿菌不同表達系統(tǒng)表達的米曲霉果糖基轉(zhuǎn)移酶AoFT酶學性質(zhì)的不同(溫度，pH等）；通過分析畢赤酵母表達的米曲霉果糖基轉(zhuǎn)移酶AoFT糖基化位點的不同，解釋酶學性質(zhì)變化的原因。
　　實驗結(jié)果表明：
　　(1)重組基因工程菌E.coli B

6、L21經(jīng)IPTG誘導能夠表達目的蛋白酶米曲霉果糖基轉(zhuǎn)移酶AoFT，SDS-PAGE結(jié)果顯示該目的蛋白分子量約68KDa,與預期結(jié)果相符，純化回收率達到33.6％，比活力為65.8U/mg。
　　(2)大腸桿菌表達的米曲霉果糖基轉(zhuǎn)移酶AoFT最適反應溫度和最適反應pH分別為50℃和6.0。在溫度范圍30-50℃處理1小時可以保持80%以上活性；果糖基轉(zhuǎn)移酶AoFT還具有較髙的pH穩(wěn)定性，在pH5.0-7.0之間處理1小時可以保持80

7、%活性以上。此外，該酶對大多數(shù)的金屬離子、表面活性劑(Tween20、Triton-X100)和有機溶劑(甲醇、乙醇、丙酮、正丁醇、甲醛、DMF、DMSO等）具有較好的抗性。變形劑SDS和尿素對該酶活性抑制作用較強，但是該酶轉(zhuǎn)糖基活性不受EDTA抑制，表明該酶不是金屬酶。
　　(3)重組基因工程菌X33經(jīng)甲醇誘導表達果糖基轉(zhuǎn)移酶AoFT,SDS-PAGE結(jié)果顯示該目的蛋白分子量約90KDa,純化回收率達到70.6%，比活力為71.

8、41U/mg。該酶最適反應溫度為45℃，在20-60℃范圍內(nèi)，熱處理1h后該酶仍保持50%以上的活性；最適pH為5.5，且在pH4.0-7.0范圍內(nèi)相對酶活均在60%以上。大多數(shù)金屬離子、常見表面活性劑和EDTA對酶活影響不明顯，并且該酶對有機溶劑有較好的抗性。此外，還原劑DTT對酶活性有抑制作用，且濃度越大抑制作用越強；高濃度的酶抑制劑對該酶具有較強的抑制作用。
　　(4)來自畢赤酵母表達的果糖基轉(zhuǎn)移酶AoFT比來自大腸桿菌表達