人熱休克蛋白HSP70與HBVPreS1相互作用的研究.pdf

1、目的：以HSP70與PreS1的相互作用為基礎(chǔ)，以HSP70參與調(diào)控HBV病毒分泌作為研究對(duì)象，闡明HSP70在包漿內(nèi)引導(dǎo)HBV病毒顆粒向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌的機(jī)制，同時(shí)為開發(fā)以阻斷HBV分泌的新型抗病毒藥奠定基礎(chǔ)。
　　方法：⑴分子克隆技術(shù)構(gòu)建pW28-HSP70原核表達(dá)質(zhì)粒，在大腸桿菌（Eecherichia coli, E.coli）B834中獲得可溶性上清表達(dá)，通過蛋白純化技術(shù)純化。分子克隆技術(shù)構(gòu)建HSP70腺病毒，構(gòu)建穩(wěn)定表

2、達(dá)HSP70的肝癌細(xì)胞系。⑵構(gòu)建PreS1截?cái)嗥钨|(zhì)粒，獲得GST-PreS1X1, GST-PreS1X2, GST-PreS1X3融合蛋白，Pull down實(shí)驗(yàn)初步探究HSP70與PreS1的結(jié)合位點(diǎn)。⑶將PreS1截?cái)酁榘被釟埢?，獲得GST-PreS1Δ1-13, GST-PreS1Δ1-44, GST-PreS1Δ16-27, GST-PreS1Δ21-33,GS T-PreS1-Δ21-47, GST-PreS1Δ31-4

3、7, GST-PreS1Δ41-53融合蛋白，通過微量熱泳動(dòng)技術(shù)（Microscale Thermophoresis，MST）找出在HSP70與PreS1在相互結(jié)合中發(fā)揮重要作用的位點(diǎn)。⑷通過定點(diǎn)突變技術(shù)獲得HSP70突變體，表達(dá)純化突變型蛋白?？兹妇G定磷法檢測(cè)野生型及突變型HSP70的ATPase活性。⑸通過qRT-PCR，western blot檢測(cè)肝癌細(xì)胞系中HBV對(duì)HSP70的影響；檢測(cè)HSP70對(duì)HBV的轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平的影

4、響。⑹通過qRT-PCR，western blot，ELISA檢測(cè)HSP70在HepG2.2.15及AD38細(xì)胞系中，對(duì)HBV分泌水平的影響。⑺通過高通量測(cè)序篩選與HBV分泌相關(guān)因子探究HBV分泌相關(guān)機(jī)制。
　　結(jié)果：①pW28-HSP70重組質(zhì)粒在E.coli中獲得可溶性上清表達(dá)。經(jīng)純化HSP70蛋白純度達(dá)85％以上。成功構(gòu)建pAd-HSP70重組腺病毒，并在HepG2.2.15中穩(wěn)定表達(dá)。②獲得純度90%以上的GST-PreS

5、1X1, GST-PreS1X2, GST-PreS1X3融合蛋白， Pull down實(shí)驗(yàn)證實(shí) HSP70蛋白能夠與 GST-PreS1X1, GST-PreS1X2, GST-PreS1X3蛋白分別結(jié)合。③PreS1的30-45個(gè)氨基酸殘基在與HSP70的結(jié)合中起著關(guān)鍵作用。④獲得三種突變型 HSP70蛋白，分別為 Mutant-Thr38, Mutant-Thr229, Mutant-Ser300。野生型HSP70蛋白的ATPas

6、e在37℃， tris–HCl(pH8.0)等條件下具有較好的活性。野生型HSP70蛋白ATPase活性顯著高于突變體，其檢測(cè)結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。⑤qRT-PCR結(jié)果顯示，HBV可以引起HSP70mRNA水平增高，western blot顯示HBV可以引起HSP70蛋白表達(dá)增加；同時(shí)HSP70可以抑制HBV的轉(zhuǎn)錄水平，HSP70降低HBV蛋白表達(dá)水平。⑥qRT-PCR，western blot及ELISA結(jié)果顯示HSP70在一定程度上增