熱休克蛋白HSP70在萎縮性胃炎的表達及其作用機制研究.pdf

1、胃癌仍然是目前世界上最常見的惡性腫瘤之一.最新報道指出每年新增胃癌病例870,000例,而死亡病例650,000例,占據(jù)腫瘤死因的第二位.由于缺乏有效的早期診斷方法,進展期胃癌病人的5年存活率僅有20﹪左右.國內(nèi)外均有學(xué)者提出,能否在胃癌前疾病階段就予以干預(yù)逆轉(zhuǎn)治療,即Ⅰ級預(yù)防胃癌的發(fā)生.因此深入了解胃癌前病變,有可能為胃癌的Ⅰ級預(yù)防提供科學(xué)依據(jù).慢性萎縮性胃炎是我國常見的慢性胃黏膜病變,其組織學(xué)特點表現(xiàn)為胃黏膜的慢性炎癥和胃腺體細胞的

2、丟失,并伴隨腸上皮化生或纖維組織增生.目前普遍認為萎縮性胃炎與腸型胃癌關(guān)系密切,癌變概率可達1-7.46﹪,WHO已將其定義為胃癌前疾病. 幽門螺桿菌作為Ⅰ類致癌源,是目前最為明確的萎縮性胃炎致病因子,它可以通過誘導(dǎo)萎縮性胃炎而促進胃癌的發(fā)生.幽門螺桿菌導(dǎo)致的萎縮性胃炎的發(fā)生除了與感染菌株和感染對象所處的外界因素有關(guān),還主要與宿主的內(nèi)在因素如基因易感性、細胞應(yīng)激反應(yīng)狀態(tài)等有關(guān).目前國內(nèi)外有關(guān)萎縮性胃炎的發(fā)病機制研究很少,深入探討

3、萎縮性胃炎分子機制,考慮如何調(diào)動機體細胞自身的適應(yīng)性保護機制以減少細胞損傷,正逐漸成為萎縮性胃炎等癌前疾病防治的重要課題. 熱休克蛋白70(Heat shock protein 70,HSP70)是生物進化過程中高度保守的應(yīng)激反應(yīng)蛋白,當組織或細胞遭受各種刺激損害時,HSP70作為細胞內(nèi)分子伴侶,能結(jié)合新生或未折疊蛋白,穩(wěn)定或輔助其正確的空間構(gòu)象;能結(jié)合變性蛋白,促進其降解;還能調(diào)節(jié)細胞免疫系統(tǒng),維持細胞的完整性.此外,HSP7

4、0還是重要的增殖與凋亡平衡的調(diào)節(jié)蛋白.近年來,在一些胃黏膜病變(如胃潰瘍、門脈高壓性胃病、慢性胃炎等)的損傷修復(fù)研究中發(fā)現(xiàn),誘導(dǎo)HSP70表達能增強胃黏膜細胞對各種損傷刺激的抵抗力,并促進細胞的增殖修復(fù),提示HSP70對胃黏膜細胞具有保護作用.萎縮性胃炎是各種損傷刺激長期作用于胃黏膜所致結(jié)果,但目前對于應(yīng)激反應(yīng)蛋白HSP70在萎縮性胃炎中的表達變化及其對胃黏膜細胞的具體作用機制尚不明確.本課題擬通過對萎縮性胃炎患者胃黏膜的檢測,了解HS

5、P70表達狀態(tài),并采用現(xiàn)代細胞與分子生物學(xué)技術(shù),通過建立實驗性大鼠萎縮性胃炎模型及體外幽門螺桿菌感染胃黏膜上皮細胞模型等途徑來研究HSP70對萎縮性胃炎的作用、影響及機制,為萎縮性胃炎的防治提供科學(xué)依據(jù)和尋求可行的靶向目標. 一.材料和方法: 1.收集萎縮性胃炎病人的胃鏡活檢標本,分別以免疫組化、western blot來定性定量檢測HSP70表達情況,單因素及多因線性回歸分析萎縮性胃炎與HSP70的相關(guān)性.

6、2.按"姒氏造模法"建立大鼠慢性萎縮性胃炎模型.成模后,參照1994年美國休斯頓胃炎診斷標準,分別觀察各組大鼠胃竇黏膜病理變化,定量分析胃竇腺體層厚度,單位長度內(nèi)的腺體個數(shù)、炎癥指數(shù)等指標,以免疫組化和western blot評價HSP70表達,并分別給予HSP70誘導(dǎo)劑戊四烯酮(geranylgeranylace-tone,GGA)、HSP70抑制劑櫟精及相應(yīng)溶劑二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide,DMSO)灌胃處理4

7、周.以證實HSP70水平與萎縮性胃炎形成的相關(guān)性. 3.用不同濃度櫟精抑制胃黏膜細胞AGS的HSP70表達,觀察細胞活力和細胞周期變化,檢測細胞凋亡和Bax、Bc1-2、AIF、cleaved Caspase-3等凋亡蛋白表達的情況.以HSP70s iRNA表達載體轉(zhuǎn)染AGS細胞,并利用G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株,通過小RNA干擾技術(shù),觀察HSP70對細胞增殖和凋亡的調(diào)節(jié)作用. 4.將幽門螺桿菌(ATCC700392)

8、與HSP70siRNA轉(zhuǎn)染細胞株或空載體對照細胞株共培養(yǎng),觀察HSP70表達抑制的胃黏膜細胞在模擬幽門螺桿菌感染狀態(tài)下的細胞活力和細胞增殖周期改變,并檢測Bax、Cyto c、caspase-3、caspase-6、caspase-7和AIF的表達情況;并將外源重組HSP70蛋白(50ng/m1)加入穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞與幽門螺桿菌的共培養(yǎng)液中,對比檢測Bax、細胞色素c、caspase-3、Caspas8-6、Caspase-7和AIF等凋亡

9、蛋白的表達變化. 二、結(jié)論 1.臨床和實驗動物證實萎縮性胃炎HSP70表達減少;HSP70誘導(dǎo)劑-GGA 能促進大鼠萎縮性胃炎胃黏膜細胞的修復(fù),減輕炎癥細胞的浸潤;而HSP70抑制劑-櫟精則加重了黏膜炎癥情況,這些發(fā)現(xiàn)強烈提示HSP70與萎縮性胃炎的發(fā)生發(fā)展有關(guān). 2 櫟精抑制體外胃黏膜細胞模型AGS的HSP70表達并顯著抑制細胞活力,表現(xiàn)為細胞周期的S期阻滯和細胞凋亡增加,線粒體凋亡通路相關(guān)蛋白Bax、AIF

10、、cleaved caspase-3和Bcl-2的表達變化進一步提示HSP70減少將促進萎縮性胃炎的發(fā)展.參與機制可能與HSP70調(diào)節(jié)胃黏膜細胞增殖及凋亡作用有關(guān). 3.成功建立和篩選體外穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HSP70siRNA的胃黏膜 AGS細胞株,可見該細胞HSP70表達明顯減少,細胞生長延緩,細胞周期呈s期阻滯,細胞凋亡蛋白Bax、AIF和胞漿cyto c增加,提示HSP70siRNA轉(zhuǎn)染會顯著削弱細胞自穩(wěn)調(diào)節(jié)能力,內(nèi)源HSP70對維

11、持細胞正常的生長和凋亡有重要作用,通過調(diào)節(jié)細胞增殖和凋亡平衡發(fā)揮其在損傷中的保護作用. 4.幽門螺桿菌對胃黏膜AGS細胞有明顯的早期促增殖和后期抑制作用;這種作用不依賴于HSP70表達的高低,但抑制AGS細胞HSP70表達會進一步促進幽門螺桿菌誘導(dǎo)的細胞凋亡發(fā)生,表明幽門螺桿菌與HSP在萎縮性胃炎發(fā)病中可能是二個獨立的相關(guān)因素.HSP70可以通過對細胞周期及線粒體凋亡通路蛋白的調(diào)節(jié)拮抗H.pylori誘導(dǎo)的細胞生長抑制作用.