熱休克蛋白HSP70在萎縮性胃炎的表達(dá)及其作用機(jī)制研究.pdf

1、胃癌仍然是目前世界上最常見的惡性腫瘤之一.最新報(bào)道指出每年新增胃癌病例870,000例,而死亡病例650,000例,占據(jù)腫瘤死因的第二位.由于缺乏有效的早期診斷方法,進(jìn)展期胃癌病人的5年存活率僅有20﹪左右.國內(nèi)外均有學(xué)者提出,能否在胃癌前疾病階段就予以干預(yù)逆轉(zhuǎn)治療,即Ⅰ級預(yù)防胃癌的發(fā)生.因此深入了解胃癌前病變,有可能為胃癌的Ⅰ級預(yù)防提供科學(xué)依據(jù).慢性萎縮性胃炎是我國常見的慢性胃黏膜病變,其組織學(xué)特點(diǎn)表現(xiàn)為胃黏膜的慢性炎癥和胃腺體細(xì)胞的

2、丟失,并伴隨腸上皮化生或纖維組織增生.目前普遍認(rèn)為萎縮性胃炎與腸型胃癌關(guān)系密切,癌變概率可達(dá)1-7.46﹪,WHO已將其定義為胃癌前疾病. 幽門螺桿菌作為Ⅰ類致癌源,是目前最為明確的萎縮性胃炎致病因子,它可以通過誘導(dǎo)萎縮性胃炎而促進(jìn)胃癌的發(fā)生.幽門螺桿菌導(dǎo)致的萎縮性胃炎的發(fā)生除了與感染菌株和感染對象所處的外界因素有關(guān),還主要與宿主的內(nèi)在因素如基因易感性、細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)狀態(tài)等有關(guān).目前國內(nèi)外有關(guān)萎縮性胃炎的發(fā)病機(jī)制研究很少,深入探討

3、萎縮性胃炎分子機(jī)制,考慮如何調(diào)動(dòng)機(jī)體細(xì)胞自身的適應(yīng)性保護(hù)機(jī)制以減少細(xì)胞損傷,正逐漸成為萎縮性胃炎等癌前疾病防治的重要課題. 熱休克蛋白70(Heat shock protein 70,HSP70)是生物進(jìn)化過程中高度保守的應(yīng)激反應(yīng)蛋白,當(dāng)組織或細(xì)胞遭受各種刺激損害時(shí),HSP70作為細(xì)胞內(nèi)分子伴侶,能結(jié)合新生或未折疊蛋白,穩(wěn)定或輔助其正確的空間構(gòu)象;能結(jié)合變性蛋白,促進(jìn)其降解;還能調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫系統(tǒng),維持細(xì)胞的完整性.此外,HSP7

4、0還是重要的增殖與凋亡平衡的調(diào)節(jié)蛋白.近年來,在一些胃黏膜病變(如胃潰瘍、門脈高壓性胃病、慢性胃炎等)的損傷修復(fù)研究中發(fā)現(xiàn),誘導(dǎo)HSP70表達(dá)能增強(qiáng)胃黏膜細(xì)胞對各種損傷刺激的抵抗力,并促進(jìn)細(xì)胞的增殖修復(fù),提示HSP70對胃黏膜細(xì)胞具有保護(hù)作用.萎縮性胃炎是各種損傷刺激長期作用于胃黏膜所致結(jié)果,但目前對于應(yīng)激反應(yīng)蛋白HSP70在萎縮性胃炎中的表達(dá)變化及其對胃黏膜細(xì)胞的具體作用機(jī)制尚不明確.本課題擬通過對萎縮性胃炎患者胃黏膜的檢測,了解HS

5、P70表達(dá)狀態(tài),并采用現(xiàn)代細(xì)胞與分子生物學(xué)技術(shù),通過建立實(shí)驗(yàn)性大鼠萎縮性胃炎模型及體外幽門螺桿菌感染胃黏膜上皮細(xì)胞模型等途徑來研究HSP70對萎縮性胃炎的作用、影響及機(jī)制,為萎縮性胃炎的防治提供科學(xué)依據(jù)和尋求可行的靶向目標(biāo). 一.材料和方法: 1.收集萎縮性胃炎病人的胃鏡活檢標(biāo)本,分別以免疫組化、western blot來定性定量檢測HSP70表達(dá)情況,單因素及多因線性回歸分析萎縮性胃炎與HSP70的相關(guān)性.

6、2.按"姒氏造模法"建立大鼠慢性萎縮性胃炎模型.成模后,參照1994年美國休斯頓胃炎診斷標(biāo)準(zhǔn),分別觀察各組大鼠胃竇黏膜病理變化,定量分析胃竇腺體層厚度,單位長度內(nèi)的腺體個(gè)數(shù)、炎癥指數(shù)等指標(biāo),以免疫組化和western blot評價(jià)HSP70表達(dá),并分別給予HSP70誘導(dǎo)劑戊四烯酮(geranylgeranylace-tone,GGA)、HSP70抑制劑櫟精及相應(yīng)溶劑二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide,DMSO)灌胃處理4

7、周.以證實(shí)HSP70水平與萎縮性胃炎形成的相關(guān)性. 3.用不同濃度櫟精抑制胃黏膜細(xì)胞AGS的HSP70表達(dá),觀察細(xì)胞活力和細(xì)胞周期變化,檢測細(xì)胞凋亡和Bax、Bc1-2、AIF、cleaved Caspase-3等凋亡蛋白表達(dá)的情況.以HSP70s iRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染AGS細(xì)胞,并利用G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株,通過小RNA干擾技術(shù),觀察HSP70對細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)節(jié)作用. 4.將幽門螺桿菌(ATCC700392)

8、與HSP70siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞株或空載體對照細(xì)胞株共培養(yǎng),觀察HSP70表達(dá)抑制的胃黏膜細(xì)胞在模擬幽門螺桿菌感染狀態(tài)下的細(xì)胞活力和細(xì)胞增殖周期改變,并檢測Bax、Cyto c、caspase-3、caspase-6、caspase-7和AIF的表達(dá)情況;并將外源重組HSP70蛋白(50ng/m1)加入穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞與幽門螺桿菌的共培養(yǎng)液中,對比檢測Bax、細(xì)胞色素c、caspase-3、Caspas8-6、Caspase-7和AIF等凋亡

9、蛋白的表達(dá)變化. 二、結(jié)論 1.臨床和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物證實(shí)萎縮性胃炎HSP70表達(dá)減少;HSP70誘導(dǎo)劑-GGA 能促進(jìn)大鼠萎縮性胃炎胃黏膜細(xì)胞的修復(fù),減輕炎癥細(xì)胞的浸潤;而HSP70抑制劑-櫟精則加重了黏膜炎癥情況,這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)烈提示HSP70與萎縮性胃炎的發(fā)生發(fā)展有關(guān). 2 櫟精抑制體外胃黏膜細(xì)胞模型AGS的HSP70表達(dá)并顯著抑制細(xì)胞活力,表現(xiàn)為細(xì)胞周期的S期阻滯和細(xì)胞凋亡增加,線粒體凋亡通路相關(guān)蛋白Bax、AIF

10、、cleaved caspase-3和Bcl-2的表達(dá)變化進(jìn)一步提示HSP70減少將促進(jìn)萎縮性胃炎的發(fā)展.參與機(jī)制可能與HSP70調(diào)節(jié)胃黏膜細(xì)胞增殖及凋亡作用有關(guān). 3.成功建立和篩選體外穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HSP70siRNA的胃黏膜 AGS細(xì)胞株,可見該細(xì)胞HSP70表達(dá)明顯減少,細(xì)胞生長延緩,細(xì)胞周期呈s期阻滯,細(xì)胞凋亡蛋白Bax、AIF和胞漿cyto c增加,提示HSP70siRNA轉(zhuǎn)染會(huì)顯著削弱細(xì)胞自穩(wěn)調(diào)節(jié)能力,內(nèi)源HSP70對維

11、持細(xì)胞正常的生長和凋亡有重要作用,通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡平衡發(fā)揮其在損傷中的保護(hù)作用. 4.幽門螺桿菌對胃黏膜AGS細(xì)胞有明顯的早期促增殖和后期抑制作用;這種作用不依賴于HSP70表達(dá)的高低,但抑制AGS細(xì)胞HSP70表達(dá)會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)幽門螺桿菌誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡發(fā)生,表明幽門螺桿菌與HSP在萎縮性胃炎發(fā)病中可能是二個(gè)獨(dú)立的相關(guān)因素.HSP70可以通過對細(xì)胞周期及線粒體凋亡通路蛋白的調(diào)節(jié)拮抗H.pylori誘導(dǎo)的細(xì)胞生長抑制作用.