凡納濱對蝦熱休克蛋白60、70和90與WSSV的相互作用.pdf

1、白斑綜合征病毒(WSSV)已經(jīng)給對蝦養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的危害,造成了巨大的損失。為了了解其致病機制,本論文主要針對 HSP60、HSP70和HSP90與WSSV的相互作用進行研究,主要內(nèi)容如下:
　　(1)為了研究凡納濱對蝦熱休克蛋白60(HSP60)在WSSV感染中的作用,將其克隆至表達載體 pBAD/gⅢA中,構建的重組載體pBAD/gIIIA-HSP60轉入到大腸桿菌Top10感受態(tài)細胞中,經(jīng)L-阿拉伯糖誘導約4h后,采用SD

2、S-PAGE及Western Blot分析,結果表明重組蛋白HSP60得到表達。經(jīng)Co2+親和層析純化獲得目的蛋白,制備HSP60的兔抗抗體,將抗體進行純化測定效價。Far Western檢測,ELISA和間接免疫熒光分析表明 HSP60與VP12、VP24、VP26、VP39、VP90有相互作用。將HSP60的抗體注射到對蝦體內(nèi)后再進行WSSV感染,通過計算累計死亡率觀察到在WSSV感染的前期,抗體對對蝦有一定保護作用。將HSP60注

3、射入對蝦體內(nèi)再進行WSSV感染實驗,通過累計死亡率的計算觀測到 HSP60對對蝦有一定的保護作用,并通過Real-Time PCR來檢測感染后對蝦的類淋巴、鰓內(nèi)STAT基因的表達情況和鰓中的WSSV拷貝數(shù),得知HSP60可能在WSSV感染的前期起到保護作用。
　　(2)為了研究凡納濱對蝦熱休克蛋白70(HSP70)在WSSV感染中的作用,基于熱休克蛋白的結構,將HSP70分為兩段HSP70A和HSP70P,分別克隆至表達載體pBA

4、D/gⅢA中,構建的重組載體轉入到大腸桿菌Top10感受態(tài)細胞中,經(jīng)L-阿拉伯糖誘導,采用SDS-PAGE及Western Blot分析,結果表明重組蛋白HSP70A和HSP70P得到表達。經(jīng)Co2+親和層析純化獲得目的蛋白。Far Western分析表明,HSP70A和 HSP70P與重組表達的VP24、VP26有相互作用,ELISA結果說明在設定濃度范圍內(nèi),HSP70A和HSP70P與VP24、VP26的作用與濃度成正相關。間接免疫

5、熒光分析表明,HSP70與VP24、VP26共定位于對蝦血細胞上。VP24、VP26與HSP70作用降低HSP70的ATPase活性。該研究為深入研究HSP70在WSSV感染中的作用提供依據(jù)。
　　(3)為了研究凡納濱對蝦熱休克蛋白90(HSP90)在WSSV感染中的作用,基于其自身的結構,將HSP90分為兩段即HSP90N和HSP90P。分別將其克隆至表達載體pBAD/gⅢA中,構建的重組載體轉入到大腸桿菌Top10感受態(tài)細胞中

6、,經(jīng)誘導后采用SDS-PAGE及Western Blot分析,結果表明重組蛋白HSP90N和HSP90C均得到表達。經(jīng)Co2+親和層析純化獲得目的蛋白,制備HSP90C的兔抗抗體,將抗體進行純化測定效價。通過Far Western檢測,證明HSP90C的抗體可以和HSP90N、HSP90C發(fā)生相互作用。ELISA反應和間接免疫熒光分析表明HSP90N和HSP90C與VP12、VP24、VP26、VP90之間有相互作用。將HSP90N和H

7、SP90C進行中和實驗,通過累計死亡率的計算觀測到HSP90C對對蝦有一定的保護作用,Real-Time PCR檢測感染后對蝦鰓中的WSSV拷貝數(shù),表明HSP90C可能在WSSV感染的前期起到保護作用。
　　(4)采用Real-Time PCR技術分析WSSV感染凡納濱對蝦不同時段鰓、腸、肝胰腺、肌肉、類淋巴和血細胞組織中熱休克蛋白 HSP60和HSP90基因mRNA轉錄水平的變化。結果顯示,HSP60和HSP90在這六個組織中都