pH超敏感聚原酸酯藥物載體的設(shè)計、制備及抗腫瘤活性研究.pdf

1、對于臨床上大多數(shù)癌癥的治療，化學療法是不可替代的治療策略。但化療藥物由于腫瘤選擇性差，導(dǎo)致在臨床上抗腫瘤效果不顯著，同時也會對正常組織或器官產(chǎn)生毒副作用。近些年來聚合物納米藥物傳遞系統(tǒng)的發(fā)展為解決這些問題提供了新的解決途徑，目前經(jīng)美國FDA批準上市的納米藥物如PEG化的阿霉素脂質(zhì)體（Doxil/Caelyx）、道諾霉素脂質(zhì)體(DaunoXome)等在臨床上顯著地降低了化療藥物的毒副作用，在整體上提升了病人的存活率。但是其在腫瘤部位的藥物

2、富集能力仍需進一步提高。因此，迫切需要研發(fā)一種新型的納米藥物傳遞系統(tǒng)以提高化療藥物在腫瘤部位的靶向富集能力，從而獲得更好的抗腫瘤效果。由于腫瘤組織特殊的理化特性，從血管到腫瘤細胞存在明顯的pH梯度（血管:～7.4;腫瘤組織胞外酸環(huán)境:～6.5-7.2;內(nèi)涵體:～5.0-6.0;溶酶體:～4.0-5.0），因此，可以通過精確設(shè)計pH敏感的納米藥物載體來提高抗腫瘤藥物在腫瘤部位的靶向性。目前大多數(shù)的pH響應(yīng)的納米藥物載體主要針對腫瘤細胞內(nèi)的

3、微酸環(huán)境(pH～4.0-6.0)，但是這些酸敏感藥物載體依然無法精確區(qū)分腫瘤胞外微酸環(huán)境(pH～6.5-7.2)和正常生理環(huán)境(pH～7.4)，從而導(dǎo)致相對低效的腫瘤靶向性以及不可避免的在正常組織出現(xiàn)藥物分布，也會導(dǎo)致在腫瘤細胞內(nèi)酸刺激響應(yīng)性弱、釋藥緩慢的問題。因此，有必要開發(fā)出pH超敏感的納米藥物載體，使之能夠在血管中穩(wěn)定存在并精確響應(yīng)腫瘤組織微酸環(huán)境，進而增強抗腫瘤藥物的靶向性和滅殺能力。本研究主要內(nèi)容包括：
　?、磐ㄟ^縮聚以

4、及酰胺反應(yīng)成功合成側(cè)鏈接枝聚乙二醇單甲醚(MPEG)(Mn=550，1000，2000 Da)的聚原酸酯共聚物(POEAd-g-MPEG550，POEAd-g-MPEG1000，POEAd-g-MPEG2000)，利用核磁共振(NMR)、凝膠滲透色譜(GPC)、三硝基苯磺酸法（TNBS）等對共聚物化學結(jié)構(gòu)進行表征;以POEAd-g-MPEG為基礎(chǔ)制備了空白膠束以及載阿霉素(DOX)膠束，利用動態(tài)光散射儀(DLS)、透射電鏡(TEM)、熒

5、光分光光度計等對膠束進行表征?？瞻啄z束在不同pH條件下隨時間變化的原酸酯降解、粒徑變化以及釋藥行為分別通過1NMR、DLS以及酶標儀跟蹤測定，實驗結(jié)果表明:POEAd-g-MPEG膠束在腫瘤組織微酸條件下具有pH超敏感性，并且具有粒徑動態(tài)變化行為:(i)在pH=7.4的條件下能夠穩(wěn)定存在;(ii)在pH=6.5的條件下粒徑先變小后變大;(iii)在pH=5.5的條件下膠束溶解，快速釋藥。采用MTT法檢測空白膠束對人骨髓神經(jīng)母細胞瘤細胞系

6、(SH-SY5Y)和人胚胎腎細胞系(293T)的細胞毒性以及載藥膠束對SH-SY5Y的細胞毒性。結(jié)果顯示空白膠束無細胞毒性，載藥膠束與DOX細胞毒性相似。分別利用激光共聚焦顯微鏡和流式細胞儀對三種載藥膠束的細胞攝取能力進行定性和定量評估，結(jié)果表明載藥膠束的細胞攝取能力與膠束粒徑以及PEG化程度密切相關(guān)。通過建立體外3D腫瘤模型(SH-SY5Y MCs)，分別利用激光共聚焦顯微鏡和倒置顯微鏡對載藥膠束的腫瘤滲透以及抑瘤能力進行評價;實驗結(jié)

7、果顯示，與DOX比較，載藥膠束在12小時內(nèi)成功滲透到3D多細胞球體內(nèi)部，并且在3天內(nèi)使組成3D多細胞球體的腫瘤細胞全部被殺死，這是目前文獻報道的體外抗腫瘤活性最好的納米藥物載體。
　?、仆ㄟ^縮聚以及接枝反應(yīng)成功合成側(cè)鏈接枝乳糖酸(LA)的聚原酸酯共聚物(POEAd-g-LA20，POEAd-g-LA50，POEAd-g-LA80)，利用核磁共振(NMR)、凝膠滲透色譜(GPC)、三硝基苯磺酸法(TNBS)等對共聚物化學結(jié)構(gòu)進行表征

8、;以聚合物POEAd-g-LA為基礎(chǔ)制備了空白膠束以及載阿霉素(DOX)膠束(POEAd-g-LA20-DOX,POEAd-g-LA50-DOX,POEAd-g-LA80-DOX)，利用動態(tài)光散射儀(DLS)、透射電鏡(TEM)、熒光分光光度計等對膠束進行表征。空白膠束在不同pH條件下隨時間變化的原酸酯降解、粒徑變化以及釋藥行為分別通過1NMR、DLS以及酶標儀跟蹤測定，實驗結(jié)果表明:POEAd-g-LA膠束在腫瘤組織微酸條件下具有pH

9、超敏感性，并且具有粒徑動態(tài)變化行為:(i)在pH=7.4的條件下能夠穩(wěn)定存在;(ii)在pH=6.5的條件下粒徑逐漸變大;(iii)在pH=5.5的條件下膠束快速變大，釋放藥物。采用MTT法檢測空白膠束對人肝癌細胞系(HepG2)和人胚胎腎細胞系(293T)的細胞毒性以及載藥膠束對SH-SY5Y、HepG2、鼠肝癌細胞系(H22)的細胞毒性，結(jié)果顯示空白膠束無細胞毒性;與阿霉素比較，載藥膠束對肝癌細胞系的毒性較高或與之近似，但是對SH-

10、SY5Y的毒性低于裸藥組。分別利用激光共聚焦顯微鏡和流式細胞儀對三種載藥膠束的細胞攝取能力進行定性和定量評估，結(jié)果表明載藥膠束的細胞攝取能力在肝癌細胞系中與DOX相似，但是在SH-SY5Y中低于DOX。結(jié)果暗示膠束表面的乳糖酸能夠顯著提高膠束在肝癌細胞中的攝取能力。通過建立小鼠體內(nèi)H22肝癌腫瘤模型，以DOX為對照組測定載藥膠束在體內(nèi)各個組織的藥物分布情況以及抑瘤能力;實驗結(jié)果顯示，POEAd-g-LA20-DOX具有更強的腫瘤富集以及

11、抑制腫瘤生長的能力，同時也證明了其能夠顯著降低對心臟的毒副作用。
　　⑶為了提高化療效率，具有不同氟化程度的聚原酸酯共聚物通過溫和的縮聚反應(yīng)成功制備，利用核磁共振(NMR)、凝膠滲透色譜(GPC)等對共聚物化學結(jié)構(gòu)進行表征;以共聚物為基礎(chǔ)利用乳液蒸發(fā)法制備空白納米微球(POEAd-C3、POEAd-g-F3、POEAd-g-F5)以及載阿霉素納米微球（POEAd-C3-DOX、POEAd-g-F3-DOX、POEAd-g-F5-D

12、OX），利用動態(tài)光散射儀(DLS)、透射電鏡(TEM)等對納米微球性狀進行表征。空白納米微球在不同pH條件下隨時間變化的原酸酯降解、粒徑變化以及釋藥行為分別通過1NMR、DLS以及酶標儀跟蹤測定，實驗結(jié)果表明:納米微球?qū)δ[瘤胞內(nèi)外酸環(huán)境具有pH超敏感性并且逐步取得了在在pH=7.4的條件下能夠穩(wěn)定存在，在pH=6.5條件下粒徑發(fā)生動態(tài)變化，在pH=5.5的條件下快速溶解或溶脹，完全釋放藥物。采用MTT法檢測空白納米微球?qū)epG2和29

13、3T的細胞毒性以及載藥納米微球?qū)H-SY5Y、HepG2、H22的細胞毒性，結(jié)果顯示空白納米微球無細胞毒性;POEAd-g-F-DOX對腫瘤細胞系的毒性近似于或高于DOX。分別利用激光共聚焦顯微鏡和流式細胞儀對載藥納米微球的細胞攝取能力進行定性和定量評估，結(jié)果表明POEAd-g-F-DOX的細胞攝取能力近似于或高于DOX。結(jié)果暗示氟化的納米微球能夠顯著增強其在腫瘤細胞中的攝取能力。通過建立體外3D腫瘤模型(SH-SY5Y MCs)，分

14、別利用激光共聚焦顯微鏡和倒置顯微鏡對載藥膠束的腫瘤滲透以及抑瘤能力進行評價;實驗結(jié)果顯示，POEAd-g-F-DOX在12小時內(nèi)完全占據(jù)整個MCs，并且在5天內(nèi)使組成3D多細胞球體的腫瘤細胞全部被殺死。通過建立小鼠體內(nèi)H22肝癌腫瘤模型，以DOX為對照組測定載藥膠束在體內(nèi)各個組織的藥物分布情況以及抑瘤能力;實驗結(jié)果表明，POEAd-g-F-DOX具有更強的腫瘤部位藥物富集能力、抑制腫瘤生長能力同時降低了藥物對正常組織的毒副作用。

15、　　⑷為了比較納米藥物傳遞系統(tǒng)在腫瘤細胞胞內(nèi)外不同的釋藥策略對抗腫瘤效果的影響，通過溫和的縮聚反應(yīng)成功制備了具有不同鏈長的聚原酸酯共聚物，利用核磁共振(NMR)、凝膠滲透色譜(GPC)等對共聚物化學結(jié)構(gòu)進行表征;以共聚物為基礎(chǔ)利用乳液蒸發(fā)法制備空白納米微球(POEAd-C3、POEAd-C6)以及載阿霉素納米微球(POEAd-C3-DOX、POEAd-C6-DOX)，利用動態(tài)光散射儀(DLS)、透射電鏡(TEM)等對納米微球性狀進行表征

16、?？瞻准{米微球在不同pH條件下隨時間變化的原酸酯降解、粒徑變化以及釋藥行為分別通過1NMR、DLS以及酶標儀跟蹤測定，實驗結(jié)果表明:POEAd-C3-DOX在pH=5.5和pH=6.5的條件下具有pH超敏感性，都表現(xiàn)出快速溶液、釋放藥物的行為;而POEAd-C6-DOX只表現(xiàn)出在pH=5.5條件下的刺激響應(yīng)、快速釋放藥物的行為。體外MTT以及細胞攝取實驗表明在pH=6.5條件下POEAd-C3-DOX更易被腫瘤細胞攝取并且表現(xiàn)出比POE