sTRAIL蛋白原核表達載體的構(gòu)建、表達及抗腫瘤活性研究.pdf

1、腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體（TNF-related apoptosis inducingligand，TRAIL）是TNF超家族中新發(fā)現(xiàn)的一員，是人體內(nèi)正常表達的一種蛋白分子。TRAIL蛋白能特異的與某些腫瘤細(xì)胞表面的凋亡受體結(jié)合，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，且不誘導(dǎo)正常細(xì)胞和組織凋亡，也不像已發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞凋亡因子TNF-α?xí)a(chǎn)生嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。TRAIL蛋白這一關(guān)鍵特性的發(fā)現(xiàn)，使其成為目前腫瘤治療研究中的熱點。完整的TRAIL蛋白含有281個氨

2、基酸殘基，但其完整的蛋白分子在原核細(xì)胞中可溶性低，限制了其的應(yīng)用。但TRAIL蛋白分子的114-281位氨基酸片段（soluble TRAIL，sTRAIL）在原核表達中的可溶性大大提高，且保持了活性。利用微生物作為宿主表達抗腫瘤外源蛋白，原因在于大腸桿菌表達系統(tǒng)具有遺傳背景清楚、表達量較高，利于發(fā)酵制備物的提取、純化、控制等優(yōu)點，研究工作日益受到重視。
　　本研究通過培養(yǎng)人早幼粒白細(xì)胞HL-60細(xì)胞，提取總RNA，通過RT-PC

3、R擴增sTRAIL蛋白基因片段，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET28a-sTrail。鑒定成功以及測序正確后電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，利用IPTG誘導(dǎo)成功表達sTRAIL蛋白。經(jīng)過對誘導(dǎo)溫度，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)速以及IPTG濃度的優(yōu)化，確定了在16℃、IPTG濃度為0.1mM、誘導(dǎo)時間12h的誘導(dǎo)條件下可溶蛋白含量最高。通過優(yōu)化Ni-IDA層析柱純化重組蛋白條件，SDS-PAGE蛋白電泳以及膠內(nèi)酶解質(zhì)譜鑒定，確定純化收集的蛋白為sTRAIL蛋白。純化

4、后的sTRAIL蛋白對人乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-231)、人子宮頸癌細(xì)胞(Hela)、人肝癌細(xì)胞(Hep-3B)、人結(jié)腸癌細(xì)胞(HCT-116)和人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞(H460)等腫瘤細(xì)胞有良好的抑制效果，通過MTT法檢測，在sTRAIL蛋白濃度為1200 ng/mL，作用48h后，對上述細(xì)胞的抑制率分別為32.9％、27.2％、29.7％、22.5％和10.8％，存在濃度依賴性。從倒置相差顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，越來越多的腫瘤細(xì)胞從梭形或不規(guī)則