MicroRNa-31-FIH-1調控關系在結直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其機制研究.pdf

1、結直腸癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率一直呈上升趨勢，尤其在發(fā)展中國家。全球每年約增加120萬結直腸癌新病例，60多萬人死于該疾病。目前對于結直腸癌的臨床治療主要采用以手術為主、化療和放療為輔的綜合治療，但效果并不理想。以手術為主的結直腸癌治療療效有限說明腫瘤的生物學行為特點是影響患者生存的關鍵。
　　本研究課題分析了抑癌基因缺氧誘導因子1α抑制因子(hypoxia induciblefactor1,alpha subun

2、it inbitor, HIF1AN，也稱factor inhibiting HIF-1, FIH-1)在結直腸癌中的作用，并鑒定了在結直腸癌中調控其表達的關鍵miRNA。在此基礎上，研究這一調控關系對結直腸癌發(fā)生發(fā)展過程的影響。目的是從非編碼RNA對腫瘤相關關鍵基因的調控角度來解釋結直腸癌生物學行為的分子機制，為結直腸癌的早期診斷和分子干預建立理論基礎。
　　第一部分 FIH-1在結直腸癌組織中的表達以及其臨床意義
　　目

3、的:驗證抑癌基因FIH-1在結直腸癌組織中的表達，并分析其臨床意義。
　　方法:采用免疫組織化學染色方法檢測FIH-1在結直腸癌中的表達型，同時用定量PCR檢測FIH-1在結直腸癌中的表達，并分析FIH-1的表達與結直腸癌發(fā)生以及侵襲轉移的相關性。
　　結果:免疫組織化學染色發(fā)現FIH-1在結直腸癌組織和正常腸粘膜組織中均有表達，而在結直腸癌組織的表達低于癌旁正常結直腸組織。對定量PCR技術檢測結果分析發(fā)現FIH-1在結直腸

4、癌組織中的低表達程度與結直腸癌的浸潤深度、淋巴結轉移和遠處器官轉移相關。
　　結論:抑癌基因FIH-1在結直腸癌組織中表達低于癌旁正常組織，其低表達程度與結直腸癌的發(fā)生發(fā)展相關。
　　第二部分結直腸癌miRNA-31/ FIH-1調控關系的建立
　　目的:分析鑒定調控抑癌基因FIH-1在大腸癌中表達的miRNA，研究FIH-1在結直腸癌中低表達的關鍵因素。
　　方法:利用已有的數據庫結合文獻報道，分析調控FIH-

5、1表達并且與結直腸癌相關的關鍵miRNA。通過定量PCR檢測目標miRNA與FIH-1在結直腸癌中的表達，分析兩者相關性。并通過細胞轉染技術，在細胞水平鑒定目標miRNA對FIH-1的調控關系。在此基礎上，通過熒光素酶報告基因實驗，來明確miRNA-31對FIH-1基因的直接調控關系。并對目標miRNA在結直腸癌發(fā)生發(fā)展以及預后中的作用進行進一步分析。
　　結果:在結直腸癌組織中，miRNA-31與FIH-1表達呈負性相關關系。在

6、結直腸癌細胞系HCT116和SW1116中，通過干擾和過表達miRNA-31，均發(fā)現miRNA-31負性調控FIH-1的表達水平。熒光素酶報告基因實驗證明miRNA-31直接作用于FIH-1的3'UTR，FIH-1是miRNA-31的下游靶基因。結直腸癌中miRNA-31的高表達是引起FIH-1表達下降的重要因素之一。MiRNA-31高表達的結直腸癌易侵襲轉移，患者預后較差。
　　結論:MiRNA-31與FIH-1表達呈負性相關關

7、系，FIH-1是miRNA-31下游靶基因之一;結直腸癌中miRNA-31的高表達是引起FIH-1表達下調的一個重要因素;miRNA-31的表達水平與結直腸癌的發(fā)生發(fā)展和預后相關。
　　第三部分 MiRNA-31/FIH-1調控關系對人結直腸癌細胞功能的影響
　　目的:研究miRNA-31/FIH-1調控關系對結直腸癌細胞功能的影響。
　　方法:利用細胞轉染技術，下調miRNA-31的表達。繼而通過MTT實驗檢驗miR

8、NA-31/FIH-1調控關系對結直腸癌細胞HCT116和SW1116增殖的影響;通過Transwell實驗檢驗miRNA-31/FIH-1調控關系對結直腸癌細胞HCT116和SW1116侵襲和轉移能力的影響。
　　結果:通過體外實驗降低miRNA-31在結直腸癌細胞HCT116和SW1116中的表達可以提高FIH-1的表達水平。MTT結果表明下調miRNA-31表達（上調FIH-1表達）可以抑制結直腸癌細胞HCT116和SW11

9、16的增殖能力;同樣Transwell結果表明，下調miRNA-31表達（上調FIH-1表達）可以抑制結直腸癌細胞HCT116和SW1116的侵襲和轉移能力。
　　結論:通過體外細胞實驗證實miRNA-31/FIH-1調控關系可以影響結直腸癌細胞的細胞功能，下調miRNA-31的表達可以抑制結直腸癌細胞的增殖、侵襲和轉移能力。
　　第四部分 MiRNA-31/FIH-1調控關系對裸鼠結直腸癌生長的影響
　　目的:研究m

10、iRNA-31/FIH-1調控關系在體內對結直腸癌細胞異種移植瘤的影響。
　　方法:通過慢病毒感染技術獲得miRNA-31穩(wěn)定下調的HCT116細胞，繼而通過裸鼠皮下接種miRNA-31穩(wěn)定下調的實驗組HCT116細胞，以及接種對照組HCT116細胞，構建皮下移植瘤模型，觀察瘤體體積及瘤重差異。利用免疫組織化學染色方法和Western blot方法檢驗FIH-1蛋白的表達，以驗證皮下移植瘤中的miRNA-31/FIH-1調控關系。