MicroRNa-31-FIH-1調(diào)控關(guān)系在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率一直呈上升趨勢，尤其在發(fā)展中國家。全球每年約增加120萬結(jié)直腸癌新病例，60多萬人死于該疾病。目前對于結(jié)直腸癌的臨床治療主要采用以手術(shù)為主、化療和放療為輔的綜合治療，但效果并不理想。以手術(shù)為主的結(jié)直腸癌治療療效有限說明腫瘤的生物學(xué)行為特點(diǎn)是影響患者生存的關(guān)鍵。
　　本研究課題分析了抑癌基因缺氧誘導(dǎo)因子1α抑制因子(hypoxia induciblefactor1,alpha subun

2、it inbitor, HIF1AN，也稱factor inhibiting HIF-1, FIH-1)在結(jié)直腸癌中的作用，并鑒定了在結(jié)直腸癌中調(diào)控其表達(dá)的關(guān)鍵miRNA。在此基礎(chǔ)上，研究這一調(diào)控關(guān)系對結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程的影響。目的是從非編碼RNA對腫瘤相關(guān)關(guān)鍵基因的調(diào)控角度來解釋結(jié)直腸癌生物學(xué)行為的分子機(jī)制，為結(jié)直腸癌的早期診斷和分子干預(yù)建立理論基礎(chǔ)。
　　第一部分 FIH-1在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)以及其臨床意義
　　目

3、的:驗(yàn)證抑癌基因FIH-1在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)，并分析其臨床意義。
　　方法:采用免疫組織化學(xué)染色方法檢測FIH-1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)型，同時(shí)用定量PCR檢測FIH-1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)，并分析FIH-1的表達(dá)與結(jié)直腸癌發(fā)生以及侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。
　　結(jié)果:免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)FIH-1在結(jié)直腸癌組織和正常腸粘膜組織中均有表達(dá)，而在結(jié)直腸癌組織的表達(dá)低于癌旁正常結(jié)直腸組織。對定量PCR技術(shù)檢測結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)FIH-1在結(jié)直腸

4、癌組織中的低表達(dá)程度與結(jié)直腸癌的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移相關(guān)。
　　結(jié)論:抑癌基因FIH-1在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)低于癌旁正常組織，其低表達(dá)程度與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。
　　第二部分結(jié)直腸癌miRNA-31/ FIH-1調(diào)控關(guān)系的建立
　　目的:分析鑒定調(diào)控抑癌基因FIH-1在大腸癌中表達(dá)的miRNA，研究FIH-1在結(jié)直腸癌中低表達(dá)的關(guān)鍵因素。
　　方法:利用已有的數(shù)據(jù)庫結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，分析調(diào)控FIH-

5、1表達(dá)并且與結(jié)直腸癌相關(guān)的關(guān)鍵miRNA。通過定量PCR檢測目標(biāo)miRNA與FIH-1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)，分析兩者相關(guān)性。并通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)，在細(xì)胞水平鑒定目標(biāo)miRNA對FIH-1的調(diào)控關(guān)系。在此基礎(chǔ)上，通過熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，來明確miRNA-31對FIH-1基因的直接調(diào)控關(guān)系。并對目標(biāo)miRNA在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展以及預(yù)后中的作用進(jìn)行進(jìn)一步分析。
　　結(jié)果:在結(jié)直腸癌組織中，miRNA-31與FIH-1表達(dá)呈負(fù)性相關(guān)關(guān)系。在

6、結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116和SW1116中，通過干擾和過表達(dá)miRNA-31，均發(fā)現(xiàn)miRNA-31負(fù)性調(diào)控FIH-1的表達(dá)水平。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證明miRNA-31直接作用于FIH-1的3'UTR，F(xiàn)IH-1是miRNA-31的下游靶基因。結(jié)直腸癌中miRNA-31的高表達(dá)是引起FIH-1表達(dá)下降的重要因素之一。MiRNA-31高表達(dá)的結(jié)直腸癌易侵襲轉(zhuǎn)移，患者預(yù)后較差。
　　結(jié)論:MiRNA-31與FIH-1表達(dá)呈負(fù)性相關(guān)關(guān)

7、系，F(xiàn)IH-1是miRNA-31下游靶基因之一;結(jié)直腸癌中miRNA-31的高表達(dá)是引起FIH-1表達(dá)下調(diào)的一個(gè)重要因素;miRNA-31的表達(dá)水平與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后相關(guān)。
　　第三部分 MiRNA-31/FIH-1調(diào)控關(guān)系對人結(jié)直腸癌細(xì)胞功能的影響
　　目的:研究miRNA-31/FIH-1調(diào)控關(guān)系對結(jié)直腸癌細(xì)胞功能的影響。
　　方法:利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)，下調(diào)miRNA-31的表達(dá)。繼而通過MTT實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)miR

8、NA-31/FIH-1調(diào)控關(guān)系對結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116和SW1116增殖的影響;通過Transwell實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)miRNA-31/FIH-1調(diào)控關(guān)系對結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116和SW1116侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　結(jié)果:通過體外實(shí)驗(yàn)降低miRNA-31在結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116和SW1116中的表達(dá)可以提高FIH-1的表達(dá)水平。MTT結(jié)果表明下調(diào)miRNA-31表達(dá)（上調(diào)FIH-1表達(dá)）可以抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116和SW11

9、16的增殖能力;同樣Transwell結(jié)果表明，下調(diào)miRNA-31表達(dá)（上調(diào)FIH-1表達(dá)）可以抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116和SW1116的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。
　　結(jié)論:通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)miRNA-31/FIH-1調(diào)控關(guān)系可以影響結(jié)直腸癌細(xì)胞的細(xì)胞功能，下調(diào)miRNA-31的表達(dá)可以抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力。
　　第四部分 MiRNA-31/FIH-1調(diào)控關(guān)系對裸鼠結(jié)直腸癌生長的影響
　　目的:研究m

10、iRNA-31/FIH-1調(diào)控關(guān)系在體內(nèi)對結(jié)直腸癌細(xì)胞異種移植瘤的影響。
　　方法:通過慢病毒感染技術(shù)獲得miRNA-31穩(wěn)定下調(diào)的HCT116細(xì)胞，繼而通過裸鼠皮下接種miRNA-31穩(wěn)定下調(diào)的實(shí)驗(yàn)組HCT116細(xì)胞，以及接種對照組HCT116細(xì)胞，構(gòu)建皮下移植瘤模型，觀察瘤體體積及瘤重差異。利用免疫組織化學(xué)染色方法和Western blot方法檢驗(yàn)FIH-1蛋白的表達(dá)，以驗(yàn)證皮下移植瘤中的miRNA-31/FIH-1調(diào)控關(guān)系。