Cullin1在腎癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：研究Cullin1基因在腎癌中的表達(dá)情況及其在腎癌細(xì)胞增殖、遷移與侵襲中的作用，并深入研究Cullin1基因在腎癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮上述作用的分子機(jī)制。
　　方法：體外實(shí)驗(yàn)：首先利用組織微列陣技術(shù)及免疫組織化學(xué)法（IHC）檢測(cè)Cullin1在307例腎癌組織與34正常腎組織中的表達(dá)情況，分析Cullin1（Cul1）表達(dá)與臨床病理因素及腎癌患者生存預(yù)后的關(guān)系；然后用在體外化學(xué)合成的Cullin1 siRNA和Control

2、siRNA轉(zhuǎn)染人腎癌786-O及ACHN細(xì)胞，用Western Blot技術(shù)檢測(cè)Cullin1 siRNA干涉Cullin1蛋白表達(dá)的效果，用CCK-8及細(xì)胞周期流式分析檢測(cè)Cullin1 siRNA轉(zhuǎn)染后腎癌細(xì)胞增殖情況的變化，用遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染Cullin1 siRNA后腎癌細(xì)胞遷移與侵襲能力的變化，用Western Blot實(shí)驗(yàn)研究Cullin1 siRNA干涉腎癌786-O及ACHN細(xì)胞后，腎癌細(xì)胞中Cyclins、p21

3、、p27、MMP-2、MMP-9、TIMP-1及TIMP-2蛋白表達(dá)的變化情況。
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：通過慢病毒重組技術(shù)將Cullin1 siRNA和Control siRNA序列整入慢病毒中，再用整合好的慢病毒轉(zhuǎn)染786-O-Luc細(xì)胞，用嘌呤霉素篩選轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞一個(gè)月，之后選擇BALB/c裸鼠，用 PBS重懸786-O-Luc-Cullin1-shRNA及786-O-Luc-Control-shRNA細(xì)胞，細(xì)胞密度約為1×107個(gè)/

4、200μL，每只老鼠皮下注射Control shRNA及Cullin1 shRNA細(xì)胞200μL，一月后用小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)檢測(cè)皮下成瘤生物發(fā)光信號(hào)，觀察其成瘤情況。
　　結(jié)果：
　　體外實(shí)驗(yàn)：
　　1、免疫組織化學(xué)法（IHC）顯示：Cullin1在腎癌組織的表達(dá)高于正常腎組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Cullin1的表達(dá)在T4期腎癌患者中明顯高于T1-T3期患者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Culli

5、n1的表達(dá)情況與患者的疾病相關(guān)存活率及總生存率無關(guān)(P>0.05)。
　　2、Western Blot實(shí)驗(yàn)顯示：與Control siRNA組相比，轉(zhuǎn)染Cullin1 siRNA后腎癌786-O和ACHN細(xì)胞中的Cullin1蛋白表達(dá)量下降；
　　3、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示：轉(zhuǎn)染Cullin1 siRNA的腎癌786-O和ACHN細(xì)胞增殖能力與Control siRNA組相比明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（786-O組P<0.05，A

6、CHN組P<0.05），流式分析顯示在干涉Cullin1的表達(dá)后兩種細(xì)胞G1期細(xì)胞數(shù)增多，S期減少；
　　4、細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)顯示：Cullin1 siRNA轉(zhuǎn)染腎癌786-O和ACHN細(xì)胞后，其穿過Transwell小室的細(xì)胞的數(shù)目與Control siRNA組相比分別下降了53％和79%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（786-O組P<0.05，ACHN組P<0.05）；
　　5、細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)顯示：Cullin1 siRNA轉(zhuǎn)染腎癌786

7、-O和ACHN細(xì)胞后，其穿過Transwell小室的細(xì)胞數(shù)目與Control siRNA組相比分別下降了95%和74%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（786-O組P<0.05，ACHN組P<0.05）；
　　6、Western Blot實(shí)驗(yàn)顯示：腎癌786-O和ACHN細(xì)胞轉(zhuǎn)染Cullin1 siRNA后，與對(duì)照組相比其p21、p27、TIMP-1蛋白表達(dá)量增多，Cyclin D1、Cyclin E2、MMP-9蛋白表達(dá)量下降，MMP-2及T

8、IMP-2蛋白表達(dá)量無變化。
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：與Control shRNA組相比，Cullin1 shRNA組裸鼠皮下生物發(fā)光信號(hào)明顯減弱，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：Cullin1在腎癌組織中呈高表達(dá),表明其可能是一個(gè)促癌基因，干涉Cullin1基因可以通過增加周期蛋白抑制p21及p27蛋白的表達(dá)來抑制周期蛋白Cyclin D1及Cyclin E2的表達(dá)從而抑制細(xì)胞增殖，此外干涉腎癌Cullin1基