FSTL1在腎癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、[背景]
　　腎細(xì)胞癌(Renal cell carcinoma，RCC)是最常見(jiàn)的泌尿系惡性腫瘤之一。由于RCC對(duì)放化療不敏感，免疫治療的療效有限，靶向治療顯示出一定前景，但存在個(gè)體差異，因此晚期RCC患者和轉(zhuǎn)移的RCC患者預(yù)后差，五年生存率不到10％。以上究其根本原因是RCC的發(fā)生發(fā)展機(jī)制尚不明確。眾多證據(jù)表明，NF-κB炎癥信號(hào)通路在腎癌中處于持續(xù)激活狀態(tài)。我們前期應(yīng)用Microarray的方法發(fā)現(xiàn)卵泡抑素樣蛋白1(Foll

2、istatin-like protein1，F(xiàn)STL1)可能與RCC轉(zhuǎn)移相關(guān)，且RCC中FSTL1的轉(zhuǎn)錄水平由癌旁正常組織、原位癌組織到轉(zhuǎn)移癌組織，呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，提示其可能發(fā)揮抑癌基因的作用。FSTL1是一種由非免疫細(xì)胞表達(dá)分泌的炎癥相關(guān)蛋白。本研究擬結(jié)合宏觀人群研究和微觀分子水平兩方面，探討FSTL1基因的單核苷酸多態(tài)性(Single NucleotidePolymorphism，SNP)、基因表達(dá)與RCC發(fā)生發(fā)展的關(guān)系及臨床意

3、義，由此為豐富RCC發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)和預(yù)后標(biāo)志物提供科學(xué)依據(jù)。
　　[材料與方法]
　　1.采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)和免疫組化的方法檢測(cè)FSTL1在腎癌細(xì)胞（786-O，ACHN及我室自行建立的漢族人腎癌細(xì)胞株NRCC）和95例臨床組織樣本中的表達(dá)分布特點(diǎn)，及其與腎癌腫瘤分期的相關(guān)性。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，評(píng)價(jià)FSTL1蛋白表達(dá)在腎癌預(yù)后預(yù)測(cè)中的價(jià)值。
　　2.通過(guò)檢索

4、國(guó)際人類基因組單體型圖計(jì)劃，采用Haploview軟件搜索FSTL1相關(guān)的標(biāo)簽SNP位點(diǎn)。采用流行病學(xué)病例對(duì)照研究方法、應(yīng)用Taqman探針-實(shí)時(shí)定量PCR法對(duì)FSTL1相關(guān)SNP位點(diǎn)(rs11708686，rs2673704，rs1259293，rs1402372，rs1105219，rs1259339)在417例腎癌樣本和855例正常對(duì)照樣本中進(jìn)行分型檢測(cè)，使用在線分析工具(http://ihg.gsf.de)檢驗(yàn)任意SNP在對(duì)照組

5、中的基因分型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡。采用Logistic回歸分析FSTL1相關(guān)SNP與腎癌發(fā)病的相關(guān)性，使用Kaplan-Meier分析FSTL1相關(guān)SNP的基因型與預(yù)后的關(guān)系。
　　3.構(gòu)建FSTL1真核表達(dá)載體和特異性沉默F(xiàn)STL1的shRNA載體，轉(zhuǎn)染至腎癌細(xì)胞株(786-O、ACHN、NRCC)中，觀察過(guò)表達(dá)和沉默效果;通過(guò)軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)、Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)、RT-PCR等方法

6、考察FSTL1基因?qū)CC細(xì)胞表型和生物學(xué)行為的影響。
　　4.采用cDNA表達(dá)譜芯片分析NRCC中沉默F(xiàn)STL1后的基因表達(dá)變化，采用DIVID分析法和GSEA分析法分別對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行通路富集和功能預(yù)測(cè)，并采用RT-PCR、Western Blot、報(bào)告基因?qū)ι鲜鲱A(yù)測(cè)到的FSTL1參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)行驗(yàn)證。
　　5.體外模擬腫瘤炎性缺氧的微環(huán)境，通過(guò)RT-PCR、Western Blot對(duì)FSTL1下游相關(guān)通路間的交

7、互作用進(jìn)行考察，尋找下游交叉節(jié)點(diǎn)分子。利用免疫共沉淀、質(zhì)譜鑒定，篩選介導(dǎo)相互作用的候選分子。
　　[結(jié)果]
　　1.與人正常胚胎腎上皮細(xì)胞293T相比，F(xiàn)STL1在腎癌細(xì)胞(ACHN、MRCC和NRCC)中低表達(dá)(p＜0.05)，在腎癌細(xì)胞786-O中高表達(dá)(p＜0.05)。免疫組化分析顯示FSTL1蛋白在癌組織中的表達(dá)水平顯著低于配對(duì)的癌旁正常組織(p＜0.001);癌組織中FSTL1蛋白表達(dá)量與腫瘤分期呈負(fù)相關(guān)(p=0.

8、013，r=-0.264)。腎癌組織中FSTL1表達(dá)為陰性的患者術(shù)后平均生存時(shí)間97.22個(gè)月，癌組織中FSTL1表達(dá)為陽(yáng)性的腎癌患者術(shù)后平均生存時(shí)間115.84個(gè)月(Log-rank檢驗(yàn)p=0.138)。
　　2.在正常對(duì)照組樣本中，六個(gè)基因多態(tài)性位點(diǎn)的基因型頻率均符合Hardy-Weinberg平衡(p＞0.05)。以腎癌患者為病例組，攜帶rs1259293位點(diǎn)CC基因型者較TT基因型其腎癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)升高(OR=2.004，95

9、％CI=1.190-3.375，p=0.009);以RCC的主要病例類型——腎透明細(xì)胞癌患者為病例組獲得相似結(jié)論(OR=2.014，95％CI=1.171-3.463，p=0.011)，提示rs1259293位點(diǎn)CC基因型為腎癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素。本研究中未發(fā)現(xiàn)rs11708686，rs1105219，rs1259339，rs1402372和rs2673704與RCC危險(xiǎn)性之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)。攜帶rs1259293 TT/CT基因型的RCC患

10、者平均術(shù)后總生存期為129.17個(gè)月，顯著高于攜帶CC基因型的RCC患者的平均術(shù)后總生存期79.63個(gè)月(p=0.022)。
　　3.在穩(wěn)定沉默F(xiàn)STL1的NRCC細(xì)胞中，與對(duì)照NRCC shsiscramble細(xì)胞相比，NRCC shFSTL1-2的克隆形成能力、遷移侵襲能力顯著升高，NRCCshFSTL1-1/2的N-cadherin表達(dá)量顯著上升(p＜0.01)，E-cadherin表達(dá)量顯著下降(p＜0.01)。ACHN、

11、786-O也獲得相似的結(jié)論。NRCC中沉默F(xiàn)STL1后，G0/G1期細(xì)胞數(shù)減少，S期和G2/M期細(xì)胞數(shù)增多;細(xì)胞表面標(biāo)志物CD99、N-cadherin、EpCAM表達(dá)增多，CD24表達(dá)減少。以上結(jié)果提示，過(guò)表達(dá)FSTL1能夠抑制腫瘤的生長(zhǎng)、增殖，遷移和侵襲;沉默F(xiàn)STL1后能夠促進(jìn)腎癌細(xì)胞生長(zhǎng)，增殖，遷移和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，RCC細(xì)胞粘附水平降低，啟動(dòng)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過(guò)程。
　　4.Affymetrix Hu

12、man U133 Plus2.0表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)分析顯示，沉默F(xiàn)STL1表達(dá)后NRCC shFSTL1-1/2細(xì)胞中共有105個(gè)差異表達(dá)基因（48個(gè)共同表達(dá)下調(diào)和57個(gè)共同表達(dá)上調(diào)）。以富集錯(cuò)判率小于25％為標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)用GSEA軟件分析發(fā)現(xiàn)FSTL1沉默的NRCC細(xì)胞中共有12個(gè)功能基因亞集表達(dá)下調(diào)和23個(gè)功能基因亞集表達(dá)上調(diào)，包括TNFα、NF-κB、HIF1α和HIF2α相關(guān)功能基因亞集顯著性富集且上調(diào)表達(dá)。ACHN、786-O和NRC

13、C細(xì)胞沉默F(xiàn)STL1后IL-6和HIF1α的轉(zhuǎn)錄水平顯著上升(p＜0.05); ACHN和786-O細(xì)胞中過(guò)表達(dá)FSTL1后，HIF1α的轉(zhuǎn)錄水平顯著下降(p＜0.05)，IL-6的轉(zhuǎn)錄水平未見(jiàn)顯著變化。Western blot結(jié)果顯示，TNFα刺激30分鐘時(shí)，與對(duì)照組NRCC shsiscramble相比，NRCC shFSTL1-1/2組細(xì)胞中Iκ-Bα表達(dá)量顯著降低，提示沉默F(xiàn)STL1表達(dá)后NF-κB信號(hào)通路活性升高。NF-κB報(bào)

14、告基因分析發(fā)現(xiàn)，在ACHN和786-O中沉默F(xiàn)STL1后，NF-κB轉(zhuǎn)錄活性升高，而過(guò)表達(dá)FSTL1后，NF-κB轉(zhuǎn)錄活性降低，以上結(jié)果提示FSTL1可能通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)途徑和HIF信號(hào)途徑發(fā)揮抑癌作用。
　　5.采用DFX和TNFα刺激模擬腫瘤生長(zhǎng)的缺氧/炎性環(huán)境，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DFX刺激后，786-O和ACHN細(xì)胞中IL-6轉(zhuǎn)錄水平顯著升高(p＜0.05); TNFα刺激后，ACHN細(xì)胞中HIF通路下游基因PGK1表達(dá)水平升高

15、(p＜0.01)。Western blot檢測(cè)結(jié)果提示，加入DFX刺激后，ACHN、MRCC和NRCC細(xì)胞中Iκ-Bα表達(dá)量降低，NF-κB通路活性增強(qiáng)，加入TNFα后，786-O、ACHN和MRCC細(xì)胞中，HIF2α表達(dá)量升高，HIF信號(hào)途徑活性增強(qiáng)，并且無(wú)論單獨(dú)加入DFX或TNFα，或兩者共同處理細(xì)胞，786-O、MRCC和NRCC中pAkt和pGSK表達(dá)量均升高。以上結(jié)果提示，腎癌細(xì)胞中FSTL1的下游通路HIF和NF-κB信號(hào)途

16、徑存在交叉調(diào)節(jié)情況，均可激活PI3K信號(hào)通路。利用免疫共沉淀、質(zhì)譜鑒定，發(fā)現(xiàn)CDC24、TUBB、CCT3等分子可能參與HIF與NF-κB途徑的交互作用導(dǎo)致的PI3K通路活性增強(qiáng)。
　　[結(jié)論]
　　RCC患者癌組織中FSTL1的表達(dá)水平較癌旁正常組織顯著下調(diào)，且癌組織中FSTL1表達(dá)水平與病理分期呈負(fù)向相關(guān)。首次發(fā)現(xiàn)FSTL1基因rs1259293位點(diǎn)多態(tài)性與RCC發(fā)病有關(guān)，CC基因型為RCC發(fā)病的危險(xiǎn)因素，且CC基因型與