精漿游離mRNA一般特征及附睪液游離mRNA功能的初步研究.pdf

1、第一部分目的：建立提取cfsRNA的有效方法，了解其含量、種類、來源。為進(jìn)一步探索cfsRNA的臨床應(yīng)用價(jià)值及存在意義奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：收集精液參數(shù)正常的男性精液標(biāo)本，聯(lián)合應(yīng)用Trizol LS Reagent和Rneasy Kit 提取和純化cfsRNA，RT-qPCR 擴(kuò)增管家基因β-actin (ACTB)比較純化前后RNA 提取效果，建立穩(wěn)定的提取純化技術(shù)，RT-qPCR 擴(kuò)增ACTB分析精液參數(shù)正常男性cfsRN

2、A 含量，并通過瓊脂糖凝膠電泳和Agilent 2100Bioanalyze（Lab on chip）的雙重檢測(cè)，驗(yàn)證cfsRNA質(zhì)量及種類。用Affymetrix 公司的HumanGene 1.0ST Array，分析精液參數(shù)正常的男性cfsRNA的mRNA種類及來源。
　　 結(jié)果：聯(lián)合應(yīng)用Trizol LS Reagent和Rneasy Kit 提取和純化的cfsRNA，用于熒光定量RT-PCR 所得到的ct值比不純化所提取

3、cfsRNA 明顯提前，差異有顯著性意義（P<0.01）。對(duì)10例精液參數(shù)正常標(biāo)本分析，cfsRNA 含量范圍為每毫升精漿0.87 μg 到3.64 μg，RNA分子完整性指數(shù)RIN（RNA Integrity Number）
　　 為6.4。28S與18S 倒置，比值為0.6。Agilent 2100Bioanalyze的結(jié)果分析說明cfsRNA 可能種類繁多，包括28S rRNA, 18S rRNA和小分子RNA（如5S r

4、RNA,tRNA，microRNA等）及在這一范圍間大量存在的大小不等的mRNA分子。
　　 cfsRNA 芯片分析結(jié)果共20106種轉(zhuǎn)錄子存在，已知基因14,575個(gè)，其中12,089為已知基因，并有基因表達(dá)信息，其余為假基因、未知功能轉(zhuǎn)錄、小RNA等。
　　 芯片結(jié)果表達(dá)信息提示cfsRNA 來源于多個(gè)男性生殖器官，其中前列腺表達(dá)而睪丸不表達(dá)2,009個(gè)，睪丸表達(dá)而前列腺部表達(dá)1,529個(gè)，前列腺和睪丸均表達(dá)2,51

5、8個(gè)，其余6,033個(gè)不在睪丸和前列腺中表達(dá)。
　　 結(jié)論：聯(lián)合應(yīng)用Trizol LS Reagent和Rneasy Kit 可獲得大量cfsRNA，能應(yīng)用于microarray、northern-blot、RT-PCR等技術(shù)。Cfs-mRNA種類繁多，來源于多個(gè)男性生殖器官?？赡艹蔀榫珴{來源器官某些疾?。ㄈ缒[瘤、基因表達(dá)異常所致疾病等）的無創(chuàng)性診斷、性犯罪法醫(yī)鑒定等方面的新分子標(biāo)志物。
　　 第二部分,目的：考慮到上述

6、應(yīng)用前景和優(yōu)勢(shì)，研究cfs-mRNA的一般特性是否滿足分子檢測(cè)技術(shù)的基本要求。本部分主要是研究精液正常男性cfs-mRNA的完整性、穩(wěn)定性、是否與其他物質(zhì)結(jié)合存在。本部分的完成將為進(jìn)一步研究病理情況下cfs-mRNA及其應(yīng)用研究奠定嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法：本部分采用分析mRNA的完整性的公認(rèn)的方法，即針對(duì)mRNA不同部位：分別設(shè)計(jì)可擴(kuò)增全長(zhǎng)及針對(duì)5′端、3′端及中段片段的引物，收集精液參數(shù)正常的精漿標(biāo)本9例，通過RT-qP

7、CR的方法定量比較ACTB、DDX4 mRNA 各自5′端、3′端及中段片段的量的差異，以轉(zhuǎn)錄子5′端為1，分析其3′端及中段相對(duì)5′端的比例，從而反映mRNA的完整性。在室溫下靜置，分別于0min、20min、45 min、90min及24 h取出400μl精漿，提取cfsRNA，熒光定量RT-PCR檢測(cè)人ACTB、DDX4 mRNA不同片段的量變及大鼠ACTB mRNA的量變規(guī)律。
　　 為分析cfsRNA是否以與大分子結(jié)合

8、形式存在而逃避精漿RNA酶的降解作用，精液參數(shù)正常男性精漿標(biāo)本分別通過直徑分別是5.0μm、0.45 μm、0.22 μm的濾膜分別過濾，運(yùn)用熒光定量RT-PCR觀察過濾前后ACTB、DDX4 mRNA的量變規(guī)律。由于Triton X-100可以分解大分子結(jié)合物質(zhì)，我們收集5人精漿，分為兩等份，一份加TritonX-100(終濃度為10ml/L)以分解蛋白質(zhì)、脂類等物質(zhì)，室溫下靜置20min，另一份在提取RNA時(shí)加入TRIzol LS后

9、加入，分別于0、5、10、20min時(shí)取400μl精漿，熒光定量RT-PCR分析精漿ACTB、DDX4 mRNA的量變規(guī)律。
　　 結(jié)果：相對(duì)于ACTB mRNA的5′端，其中段片段的相對(duì)量為71％（P<0.05），3′端片段的相對(duì)量減少到24.2％（P<0.001）。相對(duì)于DDX4 mRNA的5′端（100％），其中段片段的相對(duì)量為48.4％（P<0.05），其3′端片段的相對(duì)量減少到2.0％（P<0.001）。結(jié)果說明cfs

10、-mRNA可能主要以片段形式存在，而主要可能從mRNA3′端開始降解。
　　 精漿在室溫下靜置不同時(shí)間后，較0min時(shí)間ACTB mRNA的量，ACTB mRNA的5′端、3′端及中段在24 h內(nèi)均無明顯減少（P>0.05），說明ACTB mRNA是穩(wěn)定的。DDX4 mRNA的5′端在24 h內(nèi)穩(wěn)定（P>0.05），而DDX4 mRNA中段的含量在90min時(shí)開始慢慢減少，24 h后已經(jīng)降解到最初的25.8％（P<0.01,）3

11、′端含量在20min已降到了27.4％，90min時(shí)已檢測(cè)不到（P<0.001）。
　　 精漿通過5.0μm的濾膜，與未過濾組比較，5.0μm的濾膜對(duì)ACTB、DDX4mRNA水平均無影響，表明沒有殘余細(xì)胞的影響。而與未過濾組比較，通過0.45μm、0.22 μm的濾膜后ACTB mRNA分別減少到55.2％和27.2％，DDX4 mRNA分別減少到56.0％和39.4％(P<0.05)，說明精漿過濾后cfs-mRNA減少可能主

12、要是與大分子結(jié)合存在。為進(jìn)一步證實(shí)cfs-mRNA穩(wěn)定性與復(fù)合物結(jié)合有關(guān)，我們向精漿標(biāo)本中加入Triton X-100，cfs-mRNA穩(wěn)定性明顯下降，在室溫條件下處理10min，20min后，ACTB mRNA5′端水平下降到6.1％和2.3％, DDX4 mRNA5′端水平10min后已檢測(cè)不到。說明RNA-分子復(fù)合物結(jié)合是cfs-mRNA穩(wěn)定存在與精漿中的關(guān)鍵機(jī)制。
　　 結(jié)論：精漿中有完整的cfs-mRNA存在，但主要以

13、片段形式存在，且可能從mRNA3′端開始降解。Cfs-mRNA可能是以與大分子物質(zhì)形成復(fù)合物而存在于精漿中，盡管cfsRNA在精漿中相對(duì)穩(wěn)定，但我們建議后續(xù)的研究或臨床應(yīng)用中為保證更好的cfsRNA質(zhì)量，獲得精漿標(biāo)本后應(yīng)立即放置液氮或-80℃保存，尤其是要對(duì)3′端分析時(shí)。
　　 目的：由于cfsRNA大量存在于精漿中，且精漿小體（seminAlmicroparticles，SMPs）已被證實(shí)是穩(wěn)定且大量的精漿物質(zhì)之一。我們推測(cè)c

14、fsRNA可能存在于來自不同男性生殖器官來源的SMPs中，后者是保護(hù)游離保護(hù)游離RNA不被環(huán)境中RNA酶降解的物質(zhì)。
　　 方法：精液標(biāo)本選自精液參數(shù)正常的男性及嚴(yán)重少精子癥患者。分離SMPs并通過透射電鏡觀察形態(tài)，為獲得包裹在SMPs內(nèi)的cfsRNA，分別將RNA 酶A加入從15例精液參數(shù)正常男性及10例嚴(yán)重少精子患者分離得到的SMPs 重懸液中，濃度為100μg/ml，37℃水浴15 min，以去除SMPs表面或是裸露存在的

15、cfsRNA。繼續(xù)加入0.25％的胰酶37℃水浴15 min 以分解SMPs 外的RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。分離純化以SMPs 形式存在的cfsRNA, 選擇管家基因及男性生殖系統(tǒng)特異mRNA 指標(biāo)進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增，分析SMPs內(nèi)是否存在cfsRNA 以及相應(yīng)比例。由于SMPs大小為直徑30nm～1.0μm 之間，將6例精液參數(shù)正常男性的SMPs 重懸液分為過濾組及未過濾組，過濾組分別通過直徑分別是0.8 μm、0.45μm、0.22

16、 μm及0.10μm的濾膜，運(yùn)用熒光定量RT-PCR，觀察與未過濾組比較，過濾不同孔徑濾SMPs內(nèi)cfsRNA的量變規(guī)律。
　　 結(jié)果：SMPs 懸液的透射電鏡觀察顯示為圓形或橢圓形微小結(jié)構(gòu)，大小不等，可成簇分布。在精液參考值正常男性cfsRNA及其SMPs 形式（smpRNA）中，六個(gè)基因：ACTB, DDX4, PRM2, DEFB129, SERPINA5及TGM4的檢出率均為100％。對(duì)于精液正常男性及嚴(yán)重少精子癥患者，

17、比較總cfsRNA與SMPs 形式存在的cfsRNA的量，ACTB, DDX4, PRM2, DEFB129, SERPINA5和TGM4 mRNA水平無明顯的降低，說明絕大多數(shù)cfsRNA 以SMPs 形式存在，足以穩(wěn)定被檢出。
　　 由于SMPs大小為直徑30nm-1.0μm 之間，精漿通過0.8 μm、0.45 μm、0.22 μm及0.10μm的濾膜后不同基因cfsRNA 含量都有一定程度減少（P＜0.01)。
　

18、　 結(jié)論：精液參數(shù)正常男性及嚴(yán)重少精子癥患者卻大部分cfsRNA 存在于SMPs中，從而保護(hù)不被精漿RNA 酶降解，是潛在的診斷疾病的新分子標(biāo)志物。這一形式的RNA 物質(zhì)是否也可以通過融合進(jìn)入精子細(xì)胞發(fā)揮功能，有待進(jìn)一步研究。
　　 第三部分，目的：本部分首先通過RT-qPCR 定量附睪游離mRNA在附睪小體中的含量，參考文獻(xiàn)選擇并用RT-PCR證實(shí)小鼠附睪尾部表達(dá)而附睪頭部區(qū)域不特異性表達(dá)基因：Crisp1。通過體外實(shí)驗(yàn)觀察

19、Crisp1mRNAs是否存在于附睪小體中，并能通過附睪小體進(jìn)入附睪頭部精子。
　　 方法：取10～12周齡BALB/c 雄性小鼠雙側(cè)附睪頭、尾部，分離精子及附睪小體。將附睪上清液分成兩份，分別用于提取附睪游離RNA（cfeRNA）和附睪小體RNA，用RT-qPCR，通過分析附睪特異性表達(dá)基因：Adam7、Crisp1、Wfdc2、Wfdc9、Defb22，定量比較附睪游離mRNA和附睪小體中的mRNA 含量。
　　 將

20、超高速離心法獲得的附睪尾部小體與附睪頭部精子用PBS 液37℃共孵育1h，通過RT-PCR 檢測(cè)附睪尾部Crisp1mRNAs是否在孵育后的附睪頭部精子中檢測(cè)到，同時(shí)，以附睪頭部未孵育的精子為陰性對(duì)照，以附睪尾部精子為陽性對(duì)照組。通過原位雜交-免疫電鏡觀察附睪尾部小體遞入Crisp1mRNAs的定位。
　　 結(jié)果：RT-qPCR 定量分析附睪游離Adam7、Crisp1、Wfdc2、Wfdc9、Defb22mRNA在附睪小體中的

21、比例, 結(jié)果顯示附睪小體內(nèi)mRNA與游離形式mRNA水平無明顯差異；通過RT-PCR的方法，分別在小鼠附睪頭、尾小體中發(fā)現(xiàn)附睪頭部小體不含Crisp1mRNA，主要在附睪尾部小體表達(dá)，推測(cè)附睪尾部上皮區(qū)域特異性表達(dá)Crisp1mRNA。分別觀察小鼠附睪頭、尾精子，發(fā)現(xiàn)附睪頭部精子不含Crisp1mRNA，主要在附睪尾部精子中表達(dá)。附睪頭部精子與附睪體尾部小體孵育后，可檢測(cè)到Crisp1mRNA，主要表達(dá)于頂體及尾部中段，其胞漿小滴未消失