精漿游離microRNA的穩(wěn)定性及作為男性不育標志物的初步探索.pdf

1、文章從以下三部分就精漿游離microRNA的穩(wěn)定性及作為男性不育標志物的初步探索進行了綜述。
　　第一部分精漿游離microRNA的分離純化
　　目的:精漿中含有大量游離miRNA,有可能成為男性不育的新標志物,由于精漿成分復雜,富含蛋白和多糖等物質(zhì),一般的提取RNA的方法不適于精漿游離miRNA的分離,因此建立一種有效提取人精漿RNA的方法以用于精漿游離
　　miRNA的分析是十分必要的。
　　方法:收集精液參

2、數(shù)正常的男性精液標本,根據(jù)精漿中富含蛋白和多糖的特點在加入Trizol LS Reagent前先用低濃度蛋白酶K消化以去除精漿中的蛋白,然后再加入PEG20000以去除多糖及其它成分。通過紫外分光法測定RNA的純度,然后再通過熒光定量PCR對3種精漿中大量存在的miRNA(miR-34a, miR-141,miR-449a)進行分析。
　　結(jié)果:改良Trizol LS法獲得的RNA純度好,產(chǎn)量高。紫外分光法測定OD260/28均接

3、近于1.8(不改良的Trizol LS法約為1.3);結(jié)果證實該種方法提取的RNA可以用于miRNA的定量分析。
　　結(jié)論:改良Trizol LS法是一種從人類精漿中提取RNA的高效、可靠的方法,這為進一步研究精漿中游離miRNA的一般特征及其與男性生殖系統(tǒng)疾病的相關(guān)性奠定了基礎(chǔ)。
　　第二部分精漿游離microRNA的穩(wěn)定性
　　目的:由于游離miRNA有望成為一種診斷的新標記物,所以在疾病診斷中越來越受到人們的重視

4、,研究精漿中游離miRNA的穩(wěn)定性是否滿足分子檢測技術(shù)的基本要求是必要的。本部分的完成將為進一步研究病理情況下精漿中游離miRNA及其在臨床中的應用奠定實驗基礎(chǔ)。
　　方法:收集精液參數(shù)正常和輸精管結(jié)扎的男性精液標本各5份。為分析精漿中游離miRNA的穩(wěn)定性,離心后各留取精漿1ml在室溫下孵育,分別于0h,2h,4h,8h和24h5個時間點取出200μl,通過real-time PCR對精漿中4種miRNA和2種piRNA進行定量

5、分析。同時選取5份輸精管結(jié)扎的男性精液標本(不含睪丸來源的piRNA)作為對照以證明精漿中RNase的活性,離心后各留取精漿1ml,再將從精液參數(shù)正常人精漿中純化的cfs-miRNA(含piRNA)加入其中,然后在室溫下孵育,分別于0min,2min,5min,10min和2h5個時間點取出200μl,最后對睪丸特異性的2種piRNA(只存在正常人精漿中,不存在于輸精管結(jié)扎的精漿中)進行定量分析。
　　結(jié)果:經(jīng)過在室溫下孵育之后,

6、精漿中內(nèi)源性游離miRNA(miR-34a, miR-141, miR-202, miR-449a, piR-013423, piR-023386)的產(chǎn)量直到24h時均無變化(P>0.05),而純化之后再加入到輸精管結(jié)扎者精漿中的外源性miRNA在室溫下孵育僅2min時大部分都已經(jīng)降解(piRNA-013423和piRNA-023386分別剩余11.7％,12.3％),從而證明精漿中RNase的活性。
　　結(jié)論:精漿中內(nèi)源性游離m

7、iRNA很穩(wěn)定,能夠通過某種機制逃脫RNase的作用而不被降解,這是其作為標志物的重要特征。
　　第三部分精漿游離microRNA作為男性不育新標志物的探索
　　目的:游離miRNA在腫瘤、心血管疾病、組織損傷、妊娠等生理病理過程中表達失調(diào),是一種很有前景的新分子標志物。我們前面的實驗證實精漿中游離miRNA很穩(wěn)定,能夠逃脫RNA酶的作用而不被降解。我們推測睪丸、附睪來源的游離miRNA可能與精子發(fā)生、成熟密切相關(guān),在某些特

8、發(fā)性男性不育,如特發(fā)性少精子癥、弱精子癥、無精子癥等患者中表現(xiàn)出一種失調(diào)的狀態(tài),而這種失調(diào)可以通過定量分析 cfs-miRNA得到反映。本實驗以特發(fā)性嚴重少精子癥為研究對象,對這一推測進行探索。
　　方法:收集18例精液參數(shù)正常和17例特發(fā)性嚴重少精子癥的男性精液,通過熒光定量PCR檢測來源于睪丸的游離miRNA(miR-202, miR-509-3-5p, miR-425, miR-504, miR-508-3, piR-514

9、)和普遍表達的miRNA(miR-30d, let-7d)在嚴重少精子癥和正常人精漿中表達的差異性。
　　結(jié)果:3種來源于睪丸的游離miRNA(miR-202, miR-509-3-5p, miR-504)在特發(fā)性嚴重少精子癥的精漿中表現(xiàn)為明顯的下調(diào),差異有顯著性意義(P<0.05);而另外3種來源于睪丸的游離miRNA(miR-425, miR-508-3p, miR-514)和let-7d在兩種精漿標本中沒有明顯的差異,差異無