泛素-蛋白酶體抑制劑對左室肥厚離子通道的影響和rs3807989與房顫的相關(guān)性研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)方面進(jìn)行論述：
　　第一部分 泛素-蛋白酶體抑制劑對左室肥厚及離子通道的影響
　　背景:左室肥厚(left ventricular hypertrophy，LVH)是心臟為適應(yīng)前后負(fù)荷增加而產(chǎn)生的左室心肌細(xì)胞體積增大，重量增加，可繼發(fā)于很多疾病，如常見的高血壓、心肌梗死、先天性心臟病及瓣膜病等。左室肥厚不僅引發(fā)心臟收縮舒張功能不全，且可導(dǎo)致心臟多種電生理異常，是心律失常的重要危險(xiǎn)因素之一，其所致心室動作電位

2、延長、復(fù)極離散度發(fā)生改變，可引起室速等致命性心律失常的發(fā)生率顯著增加。房性和室性心律失常是左室肥厚的常見并發(fā)癥。左室肥厚致心律失常的機(jī)制尚不明確，很多研究發(fā)現(xiàn)左室肥厚模型中鈣、鉀離子通道表達(dá)存在改變，提示離子通道改變與左室肥厚致心律失常有關(guān)。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitinproteasome system，UPS)主要由泛素(Ub)、泛素活化酶(E1)、泛素結(jié)合酶(E2)、泛素連接酶(E3)和26S蛋白酶體組成。UPS降解細(xì)胞內(nèi)

3、高達(dá)80-90％泛素化的蛋白質(zhì)，其不僅是清除損傷及陳舊蛋白質(zhì)的重要機(jī)制之一，而且還參與調(diào)節(jié)炎癥、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增生與分化及DNA修復(fù)等各種細(xì)胞生物學(xué)功能。早先研究UPS與腫瘤及自身免疫疾病有密切關(guān)系，現(xiàn)有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)泛素-蛋白酶體與冠心病、心肌病及心力衰竭等心血管疾病均有關(guān)，但UPS在左室肥厚及心律失常中的作用目前尚不明確。
　　目的:分別用主動脈縮窄法(transverse aortic constriction，TAC)及血管

4、緊張素Ⅱ（AngⅡ，2000ng/kg/min）微量灌注法建立野生小鼠LVH模型，檢測左心室組織中鈣離子和鉀離子通道表達(dá)的改變，并觀察泛素-蛋白酶抑制劑PYR-41、PR-957對LVH及離子通道的影響。
　　方法:取野生C57BL/6小鼠為研究對象，分別采用TAC(2W，4W)方法及AngⅡ(2000ng/kg/min)3周持續(xù)微量灌注法建立野生小鼠LVH模型，無創(chuàng)鼠尾套管血壓儀監(jiān)測小鼠血壓，彩超檢測小鼠心臟左心室前壁及后壁厚度

5、、左心室收縮及舒張末期容積，計(jì)算左心室射血分?jǐn)?shù)和縮短分?jǐn)?shù)，H&E染色檢測組織炎性細(xì)胞浸潤，采用Masson Trichrome染色及實(shí)時(shí)定量PCR分析(qPCR)檢測膠原Ⅰ型(collagenⅠ)和膠原Ⅲ型(collagenⅢ)的mRNA表達(dá)水平評估心臟纖維化，WGA染色計(jì)算心肌纖維橫截面積，實(shí)時(shí)定量PCR分析(qPCR)檢測BNP及β-MHC表達(dá)水平以評估心肌肥厚，Western blot及qPCR方法檢測肥厚心肌中心室鈣離子和鉀離子

6、通道表達(dá)水平改變。AngⅡ3周持續(xù)微量灌注法建立小鼠左室肥厚模型并設(shè)計(jì)分組，分別加用PYR-41（E1抑制劑）及PR-957（β5i抑制劑），觀察泛素-蛋白酶抑制劑對左室肥厚及離子通道的影響。
　　結(jié)果:1、與假手術(shù)組相比，TAC2周及4周小鼠模型的心臟/體重比、左室前壁及后壁厚度、心肌纖維橫截面積顯著增加。TAC4周小鼠射血分?jǐn)?shù)(EF)和短軸縮短率(FS)較假手術(shù)組顯著下降。Western blot分析發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組相比，TAC

7、2周及4周小鼠心室組織中SERCA2、CASQ2、KIR3.4、KIR2.1蛋白表達(dá)水平均降低，CACNA1C蛋白表達(dá)水平升高;其中SERCA2、KIR3.4的蛋白表達(dá)降低與CACNA1C蛋白表達(dá)水平升高有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2、與生理鹽水組相比，AngⅡ灌注3周后野生小鼠血壓明顯升高、心/重比明顯增加，左室前壁及后壁厚度、心肌纖維橫截面積顯著增加，兩組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。AngⅡ灌注組射血分?jǐn)?shù)(EF)和短軸縮短率(FS)輕度上升。實(shí)時(shí)

8、定量PCR分析(qPCR)顯示AngⅡ灌注組小鼠左室組織中BNP及β-MHC表達(dá)水平顯著升高。Western blot及qPCR分析發(fā)現(xiàn)與生理鹽水組相比，AngⅡ灌注組小鼠左室組織中SERCA2、CASQ2、RyR2、CACNA1C、KCNQ1及KIR3.4蛋白及mRNA表達(dá)水平均降低，KIR2.1蛋白及mRNA表達(dá)水平均略上升，其中SERCA2、CASQ2及KIR3.4的表達(dá)降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　3、與AngⅡ+DMSO組相比

9、，AngⅡ+PYR-41組小鼠的心重比、左室前壁及左室后壁厚度明顯降低，差別有顯著性意義(P＜0.05);與AngⅡ+DMSO組相比，AngⅡ+PYR-41組小鼠左室組織SERCA2及KIR3.4蛋白的表達(dá)水平均有升高，但無顯著性差異。
　　4、與AngⅡ+DMSO組相比，AngⅡ+PR-957組小鼠的左室前壁厚度顯著降低(P＜0.05)，心重比及左室后壁厚度也呈降低趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與AngⅡ+DMSO組相比，AngⅡ+PR

10、-957組小鼠左心室組織SERCA2蛋白基本無變化，KIR3.4蛋白的表達(dá)水平有所升高，但無顯著性差異。
　　結(jié)論:TAC(2W，4W)方法及AngⅡ(2000ng/kg/min)3周持續(xù)微量灌注法可成功建立小鼠左室肥厚模型，并伴有多種鈣離子和鉀離子通道表達(dá)水平改變。其中SERCA2、KIR3.4蛋白表達(dá)水平均顯著降低。PYR-41可顯著改善AngⅡ所引發(fā)的小鼠左室肥厚，對AngⅡ引發(fā)左室組織SERCA2及KIR3.4蛋白的表達(dá)水

11、平降低也有一定改善作用，但無顯著性差異;PR-957改善AngⅡ所引發(fā)的小鼠左室肥厚及離子通道改變不如PYR-41顯著。提示泛素-蛋白酶體抑制劑對心血管疾病及離子通道的影響還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。
　　第二部分 中國漢族人群中CAV1基因rs3807989多態(tài)性與房顫的相關(guān)性研究
　　背景:心房顫動（房顫，AF）是臨床最常見的心律失常之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)房顫在普通人群中的發(fā)病率約為1-2％，其發(fā)病率隨著年齡的增長而增加，80歲以上人群

12、中房顫的發(fā)病率高達(dá)10％。房顫是缺血性卒中最重要的危險(xiǎn)因素，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和壽命。高血壓、先天性心臟病、冠心病和瓣膜性心臟病等都是與房顫密切相關(guān)的心血管危險(xiǎn)因素。房顫患者中近30％無確切危險(xiǎn)及誘發(fā)因素，也稱為孤立性房顫。許多證據(jù)顯示基因因素與房顫（尤其是孤立性房顫）發(fā)病密切相關(guān)。過去短短10年里學(xué)者們通過全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)已經(jīng)證實(shí)和房顫發(fā)病有密切關(guān)系的基因有KCNQ1、KCNH2、SCN5A、KCNE2、KCNJ2、N

13、UP155、NPPA、SCN3B、4q25、ZFHX3和KCNN3基因。CAV1基因(caveolin-1 gene)主要編碼質(zhì)膜小窩蛋白，幾乎存在于所有細(xì)胞類型中，但在上皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞等小窩豐富的細(xì)胞中有較高表達(dá)。CAV1參與細(xì)胞的各種功能，如囊泡運(yùn)輸、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等。學(xué)者發(fā)現(xiàn)CAV1在心房肌中也有表達(dá)，目前有兩個(gè)獨(dú)立樣本均證實(shí)CAV1與房顫相關(guān)。Olesen MS等研究證實(shí)在加拿大人群中CAV1基因rs3807989多態(tài)性與

14、40歲以下人群孤立性房顫的發(fā)生密切相關(guān)，但此相關(guān)性尚需要在其他種族人群中行進(jìn)一步驗(yàn)證。
　　目的:在中國漢族人群中驗(yàn)證CAV1基因rs3807989多態(tài)性與房顫的相關(guān)性。
　　方法:本研究采用病例對照研究，研究對象都是漢族人，為來自大連、武漢、隨州、襄樊和十堰等城市多家醫(yī)院的患者。納入本研究的房顫患者共計(jì)839例，對照組1215例。由心內(nèi)專家小組診斷房顫。入選的房顫患者年齡均為80歲以下。孤立性房顫是指那些無高血壓、冠心?。?/p>

15、CAD）、先天性心臟病、充血性心力衰竭、缺血性卒中及糖尿病的房顫患者。采集各研究對象的血液樣本，利用Promega公司基因組DNA純化試劑盒來提取基因組DNA;25ul反應(yīng)體系來擴(kuò)增DNA片段，成分如下:LC Green染料1μl，正向引物5pmol，反向引物5pmol，基因組DNA25ng，10×PCR緩沖液2.5ul(MgC121.5 mmol/L)，dNTPs5mmol，Taq聚合酶1U，其余以超純水補(bǔ)足25ul體系。DNA擴(kuò)增完

16、畢后立刻應(yīng)用Rotor-GeneTM6000高分辨率熔解系統(tǒng)（HRM，德國）進(jìn)行rs3807989 SNP分型。在進(jìn)行每次PCR反應(yīng)和SNP分型時(shí)均將已經(jīng)基因測序的三種基因型(A/A、A/G、G/G) DNA樣本作為陽性對照、超純水為陰性對照以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。x2檢驗(yàn)計(jì)算優(yōu)勢比(OR)及95％可信區(qū)間(95％ CI)。多因素Logistic回歸分析校正性別、年齡、高血壓、冠心病后計(jì)算3種遺傳模式下校正p值(p-adj)、OR值以及

17、95％CI。
　　結(jié)果:中國漢族人群中SNP rs3807989與房顫無顯著性相關(guān)。多因素回歸分析校正多變量后，等位基因形式下P-adj=0.828，OR=1.02;顯性模式、加性模式及隱性模式下P-adj分別為0.815、0.405、0.760。進(jìn)一步把房顫患者分為孤立性房顫(31.5％)和其他類型房顫(68.5％)，數(shù)據(jù)顯示SNP rs3807989與孤立性房顫(p-adj=0.929，OR=0.990)或其他類型房顫（p-a