蛋白酶體抑制劑增強(qiáng)TRAIL介導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡及抑制侵襲的研究.pdf

1、目的：
　　骨肉瘤是嚴(yán)重危害青少年健康的最常見惡性骨腫瘤，易早期肺轉(zhuǎn)移，預(yù)后極差。目前采用的保肢性手術(shù)聯(lián)合新輔助化療，可顯著提高患者術(shù)后生存率，治療效果優(yōu)于以往的截肢性手術(shù)，且因保留了肢體，使病人的生存質(zhì)量顯著提高。但大量臨床實(shí)踐證明，大劑量聯(lián)合化療后骨肉瘤病人常產(chǎn)生耐藥性，使原本較為有效的化療藥物迅速失去對(duì)腫瘤組織的殺傷作用，從而導(dǎo)致瘤體復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。并且化療周期的進(jìn)程將產(chǎn)生較為嚴(yán)重的對(duì)肝腎功能及各系統(tǒng)的毒副作用，許多病人甚至死因

2、并非是骨肉瘤疾病本身，而是化療藥帶來的多系統(tǒng)功能損害。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的主要途徑，參與細(xì)胞內(nèi)80％以上蛋白質(zhì)的降解。近來應(yīng)用蛋白酶體抑制劑改變其酶切位點(diǎn)活性已成為抗腫瘤治療的研究熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過應(yīng)用蛋白酶體抑制劑來探討克服骨肉瘤細(xì)胞對(duì)TRAIL耐藥的機(jī)制，從而增強(qiáng)TRAIL對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的殺傷作用。
　　方法：
　　常規(guī)培養(yǎng)和傳代人骨肉瘤細(xì)胞系OS732細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，加入不同濃度的蛋白酶體抑制劑

3、MG132，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖。實(shí)驗(yàn)分為四組:對(duì)照組:細(xì)胞正常培養(yǎng)不加處理因素;TRAIL組:終濃度為1ng/ml，10ng/ml，100ng/ml;MG132組:0.1μM，1μM，10μM，聯(lián)合組:100ng/mlTRAIL和10μMMG132。培養(yǎng)24小時(shí)后，AnnexinV-FITC/PI流式檢測(cè)OS732細(xì)胞凋亡，流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞周期情況，提取細(xì)胞總蛋白，Westernblot檢測(cè)Caspase通路中Caspase-

4、3，8的表達(dá)水平，免疫熒光觀察細(xì)胞凋亡。采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)采用(x)±s表示，多組間差異顯著性選用單因素方差分析多組間比較，組間比較選用SNK方法，P＜0.05表明具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　不同濃度的TRAIL作用于OS732細(xì)胞后，細(xì)胞未出現(xiàn)明顯的凋亡增加現(xiàn)象。不同濃度的MG132作用于OS732細(xì)胞后，細(xì)胞出現(xiàn)凋亡增加，但作用不是很明顯。我們發(fā)現(xiàn)聯(lián)合TRAIL和MG132以后，與對(duì)

5、照組及單獨(dú)應(yīng)用組相比，凋亡率明顯增加，在應(yīng)用Caspase相關(guān)抑制劑以后，上述現(xiàn)象消失。細(xì)胞周期顯示細(xì)胞被阻滯在G2-M期。聯(lián)合組骨肉瘤OS732的遷移能力受到明顯抑制。Caspase通路中的Caspase3，8的表達(dá)明顯增加，DR5及P27kip1的表達(dá)也明顯升高，而MMP-9的表達(dá)降低。
　　結(jié)論：
　　MG132聯(lián)合TRAIL能顯著殺傷骨肉瘤OS732細(xì)胞，顯著抑制骨肉瘤OS732細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。激活Caspase