蛋白酶體抑制劑對(duì)腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞增殖和凋亡的影響及機(jī)制研究.pdf

1、腎間質(zhì)纖維化（RIF）是大部分終末期腎?。‥SRD）的最終結(jié)局。腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞是腎間質(zhì)纖維化主要效應(yīng)細(xì)胞之一，其增殖活化是腎間質(zhì)纖維化發(fā)生和發(fā)展的主要因素。在眾多促纖維化的因子中，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（Transforming growth factor-β1，TGF-β1）被認(rèn)為是最重要的致纖維化誘導(dǎo)因子。素蛋白酶體通路（UPP）是真核細(xì)胞內(nèi)主要的蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)。UPP主要作用是通過一系列酶聯(lián)反應(yīng)，對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)進(jìn)行選擇性降解，從而調(diào)

2、節(jié)細(xì)胞內(nèi)特殊蛋白的濃度，發(fā)揮重要作用。體內(nèi)外研究均發(fā)現(xiàn)，蛋白酶體抑制劑可使凋亡因子p53、p21、p27和Bax的活性增加，并通過阻斷IκB的泛素化降解，抑制存活因子NF-?B活性，具有抗增殖和促進(jìn)凋亡作用。 本課題采用MTT比色法、流式細(xì)胞術(shù)、Hoechst 33258染色、DNA Ladder法觀察泛素蛋白酶體抑制劑MG-132對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞的增殖及凋亡變化，并應(yīng)用Western Blot檢測(cè)相關(guān)蛋

3、白的變化，EMSA檢測(cè)NF-?B的活性，以探索其作用途徑和機(jī)制。 本研究第一部分結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，TGF-β1(5ng/ml）可促進(jìn)NRK-49F細(xì)胞增殖，MG-132（0.25~5μM)呈劑量依賴性地抑制這種效應(yīng)，使細(xì)胞生長(zhǎng)停滯在G1期；TGF-β1（5ng/ml）單獨(dú)不能誘導(dǎo)NRK-49F的凋亡(3.8％±0.4％ vs 4.7％±1.6％)，而MG-132（0.1、0.25、0.5、0.75、1.0、2.5μM）

4、預(yù)處理可呈劑量依賴性地促進(jìn)細(xì)胞凋亡；MG-132（2.5μM）+TGF-β1組及 MG-132（2.5μM）組在Hoechst染色下出現(xiàn)核固縮、核碎裂、凋亡小體等凋亡的特異的形態(tài)學(xué)改變，并在DNA電泳中呈典型的“梯狀”條帶。上述結(jié)果表示，TGF-β1(5ng/ml）可促進(jìn)NRK-49F的增殖，而泛素蛋白酶體抑制劑MG-132對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的NRK-49F有抑制增殖和促進(jìn)凋亡作用。 本研究第二部分結(jié)果顯示，MG-132可劑量依

5、賴性促進(jìn)TGF-β1誘導(dǎo)的凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3的活性片段產(chǎn)生，Bax表達(dá)上調(diào)和Bcl-2表達(dá)下調(diào)，激活細(xì)胞周期相關(guān)蛋白p21、p53，但對(duì)p27沒有明顯的影響；進(jìn)一步研究顯示TGF-β1可促進(jìn)ERK、JNK和p38蛋白磷酸化，而MG-132能抑制ERK的活化，并能進(jìn)一步激活JNK和p38蛋白及其下游c-Jun1/2，30min達(dá)高峰；TGF-β1可時(shí)間依賴性地誘導(dǎo)IκB蛋白磷酸化，而MG-132能上調(diào)TGF-β1誘導(dǎo)的IκB磷

6、酸化、IκB蛋白表達(dá)及抑制NF-?B活性。提示MG-132可能通過上述途徑發(fā)揮對(duì)NRK-49F細(xì)胞的抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡作用。因此MG-132具有潛在的抗腎間質(zhì)纖維化作用。 總之，本研究首次發(fā)現(xiàn)泛素蛋白酶體抑制劑MG-132可抑制腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞增殖，并促其凋亡。該作用可能與MG-132對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，凋亡信號(hào)蛋白、MAPK通路及NF-?B途徑蛋白的調(diào)節(jié)有關(guān)，提示泛素蛋白酶體抑制劑可能成為將來防治腎間質(zhì)纖維化的一個(gè)潛在的治療手