自噬在蛋白酶體抑制劑抗甲狀腺癌中的作用.pdf

1、目的
　　 明確蛋白酶體抑制劑對人未分化甲狀腺癌細(xì)胞的自噬活性的影響,并進(jìn)一步探討自噬在蛋白酶體抑制劑抗甲狀腺癌中的作用。
　　 方法
　　 1、實驗細(xì)胞:人未分化甲狀腺癌細(xì)胞系FRO,于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中、37℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng),2～3d傳代一次,選用對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。
　　 2、相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài);吖啶橙染色熒光顯微鏡觀察酸性囊泡的形成;脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法建立FRO-G

2、FP-LC3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系后熒光顯微鏡觀察自噬標(biāo)記物L(fēng)C3的分布;MTT比色分析法檢測蛋白酶體抑制劑對細(xì)胞增殖的影響。
　　 3、實驗分組:為明確蛋白酶體抑制劑MG132對FRO細(xì)胞自噬活性的影響,設(shè)空白對照組、MG132量效組(0.1μM、0.5μM、1μM、2μM、5μM)、MG132時效組(1μM,4h、8h、12h);為明確蛋白酶體抑制劑MG132激活FRO細(xì)胞的自噬類型,設(shè)3-MA(5mM)組、wortmannin(5

3、gM)組、MG132(2μM)組、3-MA(5mM)+MG132(2μM)組、wortmannnin(5gM)+MG132(2μM)組、饑餓誘導(dǎo)(EBSS)組、3-MA(5mM)+EBSS組、wortmannin(5μM)+EBSS組;為明確自噬抑制劑對蛋白酶體抑制劑MG132細(xì)胞毒性的影響,設(shè)CQ量效組(1μM、2μM、5μM、10μM、20μM)、wortmannin量效組(1μM、2.5μM、5μM)、MG132(0.5μM、2μ

4、M)組、CQ(各濃度)+MG132(各濃度)組、wortmannnin(各濃度)+MG132(各濃度)組。
　　 結(jié)果
　　 1、蛋白酶體抑制劑MG132對FRO細(xì)胞自噬活性的影響
　　 相差顯微鏡下,MG132作用于FRO細(xì)胞可見細(xì)胞空泡狀結(jié)構(gòu)形成;吖啶橙染色后熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),MG132誘導(dǎo)酸性囊泡的增加(P＜0.05);熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),MG132作用于FRO-EGFP-LC3細(xì)胞后,綠色熒光的點簇

5、狀聚集相比空白對照組明顯增加(P＜0.05)。
　　 2、自噬抑制劑對MGl32所激活的FRO細(xì)胞的自噬活性的影響
　　 與空白對照組相比,抑制PI3K活性的自噬抑制劑3-MA組及wortmannin組酸性囊泡或LC3的點簇狀聚集均沒有明顯的改變(P＞0.05);相比MG132組,3-MA+MG132組及wortmannin+MG132組的酸性囊泡或LC3的點簇狀聚集亦沒有明顯的改變(P＞0.05)。而依賴PI3K的經(jīng)典

6、自噬模型EBSS組與對照組相比LC3的點簇狀聚集明顯增加(P＜0.05),3-MA及wortmannin均明顯抑制了EBSS誘導(dǎo)的LC3的點簇狀聚集(P＜0.05)。
　　 3、自噬抑制劑對MG132細(xì)胞毒性的影響
　　 與空白對照組相比,自噬早期抑制劑wortmannin組對FRO細(xì)胞活力基本無影響(P＞0.05),與MG132組相比,wortmannin+MG132組對細(xì)胞活力的影響無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05);自噬