干擾HDAC2基因?qū)π∈笤缙谂咛ソM蛋白修飾的影響.pdf

1、表觀遺傳修飾如組蛋白修飾、DNA甲基化等在調(diào)控基因的表達(dá)與沉默中起重要作用。HDAC2為組蛋白去乙?；赋蓡T，主要在染色質(zhì)重塑和轉(zhuǎn)錄抑制方面發(fā)揮作用。本研究運(yùn)用RNA干擾技術(shù)對(duì)小鼠HDAC2進(jìn)行了干擾，通過(guò)抑制組蛋白去乙酰化酶的表達(dá)提高乙?；揎椝剑蕴剿鞅碛^遺傳修飾影響哺乳動(dòng)物胚胎早期發(fā)育的可能機(jī)制。
　　 1.HDAC2干擾表達(dá)載體的構(gòu)建與細(xì)胞水平上的效應(yīng)檢測(cè)
　　 根據(jù)已公布的小鼠HDAC2基因mRNA序列，以及

2、shRNA設(shè)計(jì)原則，選擇第107-126、879-898和1240-1259三個(gè)區(qū)段為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)合成干擾片段，同時(shí)設(shè)計(jì)陰性對(duì)照序列。分別成功構(gòu)建了四個(gè)表達(dá)紅熒光蛋白的干擾載體，即pCDsRed2-shRNA107、pCDsRed2-shRNA879、pCDsRed2-shRNA1240、和作為對(duì)照的pCDsRed2-shRNAcontrol。采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法，將構(gòu)建好的四個(gè)干擾載體轉(zhuǎn)染入小鼠胎兒成纖維細(xì)胞，48小時(shí)后分析轉(zhuǎn)染效果并進(jìn)行篩選

3、。利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中目的基因的表達(dá)量。結(jié)果表明，上述4個(gè)干擾載體引起目的基因的表達(dá)量分別為對(duì)照組細(xì)胞中的0.72倍、0.73倍、0.13倍和0.8倍。因此確定出HDAC2基因下游區(qū)域的1240位點(diǎn)處是最有效的干擾區(qū)域。把干擾載體分別轉(zhuǎn)染入小鼠胎兒成纖維細(xì)胞，篩選出陽(yáng)性細(xì)胞。對(duì)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞進(jìn)行組蛋白乙?；c甲基化修飾的檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)不同干擾載體引起的細(xì)胞的H4K5ac、H3K9ac、H3K9me2、H3K27me3、H3K4m

4、e3熒光信號(hào)有明顯差異。在3個(gè)載體中，干擾效率最高的是pCDsRed2-shRNA1240載體，組蛋白乙?；揎椥盘?hào)最強(qiáng)。而在甲基化修飾中，除組蛋白H3K9m2沒(méi)有明顯信號(hào)外，其他位點(diǎn)均表現(xiàn)出最強(qiáng)信號(hào)。因而，我們選用pCDsRed2-shRNA1240干擾載體作下一步的胚胎發(fā)育驗(yàn)證。
　　 2.干擾HDAC2表達(dá)對(duì)小鼠胚胎早期發(fā)育的影響
　　 利用原核注射技術(shù)，將hdac2的shRNA注射到受精卵中，然后分別收集干擾后發(fā)

5、育到2-細(xì)胞，8-細(xì)胞和囊胚期的胚胎，通過(guò)RT-PCR對(duì)胚胎進(jìn)行檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)在注射組各時(shí)期胚胎中hdac2的mRNA水平分別是對(duì)照組的96.6％，85.3％和35.6％。表明，干擾HDAC2的表達(dá)影響了小鼠胚胎發(fā)育。免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，干擾處理的2-細(xì)胞，8-細(xì)胞和囊胚期胚胎中的乙?；图谆稽c(diǎn)出現(xiàn)修飾差異。除了H3K9me2之外，H3K9ac、H4K5ac、H3K4me3和H3K27me3在胚胎的不同發(fā)育階段均高水平表達(dá)。這種修飾差