組蛋白丟失和修飾參與調節(jié)花生種子油質蛋白基因的表達.pdf

1、花生是一種重要的油料作物，其種子富含蛋白質和脂肪?；ㄉN子中的貯藏性脂肪儲藏在被稱為油體的細胞器中。油體表面存在稱為油質蛋白(Oleosin)的蛋白質，它們在種子中高效表達，而在營養(yǎng)組織中沒有表達。本文的主要目的是從花生種子中克隆種子特異表達啟動子，為研究其表達調控機理提供序列資源，同時也為植物基因工程表達載體提供可供選擇的調控元件。另外，通過研究花生油質蛋白基因在不同表達活性時其組蛋白修飾和裝配方面的差異，進一步擴展對種子特異表達基因

2、調控機理的認識。 采用定量RT—PCR技術，測定了4個花生油質蛋白基因(AhOleo14.3、AhOleo16.9、AhOleo17.8和AhOleo18.5)在種子成熟過程中的轉錄水平變化。結果顯示它們的表達模式相似，即從種子成熟早期到成熟中后期，表達量不斷提高，種子成熟晚期的表達開始下降。利用銜接頭PCR方法克隆到AhOleo17.8和AhOleo18.5基因上游啟動子區(qū)片段，長度分別為1598bp和303bp。分析兩個啟動

3、子序列，發(fā)現存在轉錄需要的重要序列以及參與種子特異表達調控有關的順式元件，如RY元件、G框、E盒、AACAA元件等。將AhOleo17.8上游啟動子區(qū)序列及4段缺失序列分別接于載體pBI101.1的GUS基因上游。成功構建插入5個AhOleo17.8啟動子缺失部分上游序列驅動GUS基因的載體(P-1598、P-1072、P—724、P—378和P-136)。用農桿菌介導的花序浸泡法轉化擬南芥得到轉化植株。對P-1072和P-136轉基因

4、的植株不同組織進行GUS染色分析，發(fā)現P-1072檢測到GUS僅在種子中存在。對其種子進行萌發(fā)后染色分析，檢測到GUS染色在植株萌發(fā)14-18天時基本消失。P-136在任何組織中都沒能檢測到GUS染色存在。上述結果說明，1072bp長的AhOleo17.8啟動子具有驅動基因在種子中特異表達的能力。 染色體免疫沉淀實驗發(fā)現在成熟后期花生種子中油質蛋白基因核心啟動子區(qū)和編碼區(qū)組蛋白H3占位水平遠遠低于根莖葉中的水平。也就是說油質蛋白

5、基因高效表達時，其核心啟動子和編碼區(qū)組蛋白發(fā)生了丟失。同時我們還觀察到組蛋白乙酰化水平的的下降，這個結果是出乎我們意料的，因為乙?；ǔＭ虮磉_正相關。但是，進一步的實驗發(fā)現在種子發(fā)育早期，油質蛋白基因核心啟動子和編碼區(qū)組蛋白H3確實發(fā)生了超乙?；?。表明乙酰化參與了該基因表達調控的早期階段。最后，實驗還發(fā)現根莖葉中油質蛋白基因核心啟動子和編碼區(qū)組蛋白H3K9雙甲基化水平高于發(fā)育早期種子。因此H3K9雙甲基化參與了油質蛋白基因在營養(yǎng)組織