靜脈移植脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞治療甘油所致大鼠腎小管損傷的研究.pdf

1、一、背景：
　　 近年來原林教授等提出筋膜學(xué)假說認(rèn)為:人體由非特異性結(jié)締組織筋膜支架所構(gòu)成的支持與儲備系統(tǒng)和被筋膜支架所包繞的功能系統(tǒng)所共同構(gòu)成。支持與儲備系統(tǒng)的筋膜支架是以干細(xì)胞為核心,為功能系統(tǒng)的更新提供細(xì)胞補(bǔ)充,并為功能系統(tǒng)的各種細(xì)胞的更新、代謝提供一個穩(wěn)定的內(nèi)部環(huán)境。脂肪組織是支持與儲備系統(tǒng)的重要組成部分,其中的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derivedmesenchymal stem cells,ADMSCs)是

2、機(jī)體重要的干細(xì)胞儲備之一。對ADMSCs深入研究,能對筋膜學(xué)假說提供部分理論支持,同時也是進(jìn)行干細(xì)胞移植取材時應(yīng)該考慮的問題。
　　 干細(xì)胞由于具有自我更新和多向分化潛能將成為重要的組織工程種子細(xì)胞,但由于胚胎干細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞以及誘導(dǎo)的多潛能干細(xì)胞存在著倫理道德或免疫排斥反應(yīng),甚至有致瘤的危險性,而脂肪干細(xì)胞由于來源簡便充足,容易大量提取獲得,移植后無免疫排斥反應(yīng),將成為組織工程比較有前景的種子細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞具備成體干細(xì)胞

3、的特征,能無限傳代和多向分化。目前已經(jīng)從多種組織中分離出間充質(zhì)干細(xì)胞,包括骨髓、脂肪、臍帶血、外周血和骨骼肌等。間充質(zhì)干細(xì)胞中研究較為深入的是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,能在一定的條件下分化為骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是首先分離的間充質(zhì)干細(xì)胞,已經(jīng)作為種子細(xì)胞在各種移植實(shí)驗(yàn)中取得了明顯的效果。近期的研究發(fā)現(xiàn),同樣具有多向分化能力的ADMSCs和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相比具有取材手術(shù)小、可重復(fù)進(jìn)行、酶消化分離程序

4、簡單等優(yōu)點(diǎn),可作為新的成體干細(xì)胞來源。
　　 在當(dāng)今社會,道路交通傷(RoadTraffioInjuryRTI)非常普遍,統(tǒng)計全世界每年約有120萬人死于道路交通傷,其中15-44歲的青壯年占一半以上。研究證實(shí)急性腎損傷(Acute Kidney Injury AKI)是創(chuàng)傷后嚴(yán)重并發(fā)癥。根據(jù)AKI定義和研究對象不同(如ICU或非ICU病人),創(chuàng)傷后AKI發(fā)生率為0.098-31.0％,死亡率高達(dá)13-78％,是造成傷員院內(nèi)死亡

5、的重要原因。RTI是現(xiàn)代創(chuàng)傷最主要的組成部分,其中50-70％的創(chuàng)傷是由于道路交通事故造成。
　　 急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)為臨床常見的急危重癥,若不能早期診斷、及時處理,常會造成不可逆的腎臟損害。急性腎損傷是一個多因素參與的病理生理過程,其發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜并且至今尚未完全明了。近年來,急性腎損傷的發(fā)病率及死亡率并沒有隨著醫(yī)療水平的提高而下降。如何防治并早期干預(yù)急性腎損傷已成為基礎(chǔ)和臨床腎臟病

6、學(xué)者研究的重要課題。近年來干細(xì)胞移植治療給腎損傷的治療帶來了希望,許多學(xué)者進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)研究。細(xì)胞移植治療腎損傷的機(jī)理可能是促進(jìn)了神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌,減少了炎癥反應(yīng),或者是替代了損傷的腎細(xì)胞。我們研究的內(nèi)容是靜脈移植ADMSCs能否促進(jìn)大鼠腎損傷的恢復(fù)以及對營養(yǎng)因子的影響。
　　 二、目的：
　　 1、分離培養(yǎng)SD大鼠的ADMSCs,并進(jìn)行表面標(biāo)志CD11b、CD29、CD45、CD49d、CD90和CD106的檢測,

7、進(jìn)行成骨成脂誘導(dǎo)檢測多向分化能力；
　　 2、不同月齡獲得的ADMSCs在成骨成脂分化能力定量測定、增殖能力、收獲率、增殖能力測定；
　　 3、靜脈移植ADMSCs能否促進(jìn)甘油所致大鼠腎小管損傷大鼠的腎恢復(fù),能否遷移到損傷區(qū)域以及對局部炎癥因子有無影響。
　　 三、方法：
　　 1、ADMSCs的分離培養(yǎng)、多向分化、表面標(biāo)志鑒定
　　 從6只SD大鼠腹股溝脂肪墊中分離培養(yǎng)ADMSCs。先將脂肪組織

8、剪碎后用Ⅰ型膠原酶消化,離心將上層脂肪細(xì)胞從間質(zhì)血管碎片中去除,然后以8000-10000cells/cm2的密度種植于培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)基為含10％胎牛血清和1％青霉素/鏈霉素的DMEM。24h后,換液去掉未貼壁細(xì)胞,貼壁細(xì)胞用來擴(kuò)增傳代。相差顯微鏡下觀察ADMSCs的形態(tài)。
　　 取第4代ADMSCs進(jìn)行成骨和成脂誘導(dǎo)分化,經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)周后用茜素紅染色檢測礦化結(jié)節(jié)。經(jīng)成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)4周后用油紅O染色檢測脂質(zhì)沉積。

9、r>　　 用流式細(xì)胞術(shù)鑒定第4代的ADMSCs的表面標(biāo)志物:CD14、CD29、CD45、CD44和CD105的表達(dá)率。
　　 2、皮下ADMSCs的獲取
　　 8只SD大鼠取腹股溝脂肪墊,培養(yǎng)擴(kuò)增ADMSCs。相差顯微鏡下觀察兩個部位來源的ADMSCs的形態(tài)。分別取兩種來源的第4代ADMSCs進(jìn)行成骨和成脂誘導(dǎo)分化。每只大鼠來源的第4代腹股溝ADSCs種植于6孔板,成脂定量方法:成脂誘導(dǎo)后用油紅O染色檢測細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉

10、積。成骨定量方法:ADMSCs成骨誘導(dǎo)后用茜素紅染色用10％西吡氯銨洗脫。
　　 3、靜脈移植ADMSCs對腎小管損傷的影響
　　 腎模型的建立大鼠置于籠中,記錄正常飲水量及尿量。大鼠給予50％甘油生理鹽水10ml/kg,雙后肢肌肉注射。靜脈移植脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞:SD大鼠ADMSCs擴(kuò)增至第四代。用第4代ADMSCs在進(jìn)行移植,培養(yǎng)3天后消化收集,用生理鹽水重懸,300萬/ml。實(shí)驗(yàn)組大鼠腎損傷6h后行ADMSCs尾靜脈

11、移植,每只大鼠經(jīng)尾靜脈注射間充質(zhì)干細(xì)胞3×106個。
　　 四、結(jié)果：
　　 SD大鼠ADMSCs呈現(xiàn)類似成纖維細(xì)胞樣形態(tài)學(xué)特征。1到4代ADMSCs在倒置顯微鏡下觀察,經(jīng)過傳代后細(xì)胞形態(tài)逐漸均一,類似成纖維細(xì)胞,多呈長梭型或者紡錘形。用第4代ADMSCs進(jìn)行成骨和成脂誘導(dǎo)分化,經(jīng)誘導(dǎo)后能向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化。成脂培養(yǎng)基內(nèi)誘導(dǎo)兩周后,部分內(nèi)脂滴積聚。細(xì)胞在培養(yǎng)皿上展開,脂滴占據(jù)細(xì)胞大部,胞核被擠于一側(cè)。油紅O染色顯示

12、特異性的紅色脂滴。成骨誘導(dǎo)后細(xì)胞逐漸聚集,并可重疊生長,兩周后可見細(xì)胞外大量鈣質(zhì)沉積,礦化結(jié)節(jié)被茜素紅染成紅色的致密結(jié)節(jié)。免疫表型分析顯示CD29和CD105呈陽性,而CD14、CD44和CD106呈陰性反應(yīng)。
　　 4代ADMSCs表面標(biāo)志中CD14、CD44和CD106均呈低表達(dá),CD29和CD105呈高表達(dá)。
　　 五、結(jié)論：
　　 1、通過這種酶消化方法獲得的SD大鼠ADMSCs具有成骨、成脂、成軟骨多向