脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)大鼠小體積肝移植術(shù)后肝損傷的治療作用及機(jī)制研究.pdf

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br>　　 小體積肝移植術(shù)后移植物損傷可嚴(yán)重影響供肝功能，甚至誘發(fā)小體積綜合征，危及受體生命。文獻(xiàn)報(bào)道脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSC)移植可緩解局部組織微循環(huán)障礙，改善肝損傷，促進(jìn)肝再生，但其能否保護(hù)小體積肝移植物未見(jiàn)報(bào)道。本研究擬探索ADSC移植對(duì)小體積肝移植物的保護(hù)作用及相應(yīng)機(jī)制。
　　 材料與方法：
　　 無(wú)菌提取大鼠腹股溝脂肪帶的ADSC，體外培養(yǎng)擴(kuò)增，并進(jìn)行誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)及表面標(biāo)記物鑒定。通過(guò)RNA干擾

2、技術(shù)構(gòu)建包含GFP及抑制大鼠VEGF表達(dá)的短發(fā)夾RNA(shRNA)或陰性對(duì)照shRNA的質(zhì)粒，經(jīng)慢病毒載體包裝后轉(zhuǎn)染ADSC，特異性阻斷ADSC表達(dá)VEGF。提取大鼠肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(LSEC)，與不同濃度的轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照shRNA的ADSC(NC-shRNAADSC)及轉(zhuǎn)染干擾VEGFshRNA的ADSC(VEGFi-shRNAADSC)共培養(yǎng)，24小時(shí)后采用AnnexinV/PI試劑盒流式檢測(cè)LSEC的凋亡比例。建立35％的大鼠小體積肝

3、移植模型，術(shù)中經(jīng)門(mén)靜脈移植2×106NC-shRNAADSC或VEGFi-shRNAADSC，對(duì)照組經(jīng)門(mén)脈輸注等體積的Hanks緩沖液。觀察各組大鼠術(shù)后100天生存情況，進(jìn)行血清肝功能及病理學(xué)檢測(cè)(H&E、透射電子顯微鏡)，采用熒光顯微鏡進(jìn)行活體肝臟灌注檢測(cè)，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR、免疫蛋白印跡檢測(cè)SFSLT術(shù)后各組肝臟內(nèi)皮素-1(ET-1)、內(nèi)皮素受體A(ETAR)、Bcl-2、Bax、Bad、p-bad的表達(dá)，采用免疫組織化學(xué)方法檢

4、測(cè)肝臟標(biāo)本PCNA、ⅤⅢ因子的表達(dá)，并檢測(cè)肝臟那個(gè)冰凍標(biāo)本的GFP熒光，示蹤移植入的ADSC。
　　 結(jié)果：
　　 (1)體外共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明：與相同數(shù)量的VEGFi-shRNAADSC相比，3×105NC-shRNAADSC與LSEC共培養(yǎng)可明顯降低LSEC的凋亡水平。(2)NC-shRNAADSC移植組大鼠的肝功能(ALT、AST)及生存率顯著高于對(duì)照組及VEGFi-shRNAADSC移植組。(3)肝臟切片H&E染色顯

5、示NC-shRNAADSC移植組大鼠的肝臟微結(jié)構(gòu)基本正常；與之相比，對(duì)照組及VEGFi-shRNAADSC移植組大鼠的肝臟結(jié)構(gòu)明顯破壞，表現(xiàn)為肝竇結(jié)構(gòu)紊亂、局灶性肝細(xì)胞壞死及匯管區(qū)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等。透射電子顯微鏡下觀察NC-shRNAADSC移植組的肝竇超微結(jié)構(gòu)基本正常，而對(duì)照組及VEGFi-shRNAADSC移植組的肝竇內(nèi)皮細(xì)胞線性結(jié)構(gòu)破壞，可見(jiàn)細(xì)胞核皺縮等凋亡表現(xiàn)。(4)活體肝臟灌注檢測(cè)顯示NC-shRNAADSC移植組的肝竇微循環(huán)狀

6、態(tài)明顯優(yōu)于對(duì)照組及VEGFi-shRNAADSC移植組，表現(xiàn)為肝竇灌注指數(shù)高、肝竇直徑小。(5)實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示NC-shRNAADSC移植組的ETAR表達(dá)水平明顯低于其他兩組，且該組的Bcl-2/Bax比值明顯高于對(duì)照組，Bad表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組及VEGFi-shRNAADSC移植組；免疫蛋白印跡結(jié)果與PCR結(jié)果一致，并表明NC-shRNAADSC移植組的p-Bad表達(dá)明顯高于其他兩組。(6)NC-shRNAADSC移植

7、組的ⅤⅢ因子及PCNA免疫組化染色陽(yáng)性的細(xì)胞比率均明顯高于對(duì)照組及。VEGFi-shRNAADSC移植組。(7)術(shù)后第1天及第7天的大鼠肝內(nèi)可見(jiàn)GFP陽(yáng)性細(xì)胞，術(shù)后第14天及第30天的大鼠肝內(nèi)未發(fā)現(xiàn)GFP陽(yáng)性細(xì)胞。
　　 結(jié)論：
　　 小體積肝移植術(shù)后脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞移植可顯著改善小體積肝移植物的肝功能、肝臟血流灌注狀態(tài)，減少肝臟細(xì)胞凋亡，并促進(jìn)肝細(xì)胞及肝臟微血管再生。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的這些作用主要是通過(guò)分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)