當(dāng)羊骨片對(duì)維甲酸致骨質(zhì)疏松大鼠OPG-RANK-RANKL系統(tǒng)的影響.pdf

1、骨質(zhì)疏松癥（Osteoporosis，OP）是一種以骨組織微觀結(jié)構(gòu)退化，骨強(qiáng)度降低，骨脆性增加，易發(fā)生骨折為主要特征的全身代謝性骨骼系統(tǒng)疾病。骨質(zhì)疏松已成為影響中老年人身心健康的公共健康問題。目前，我國骨質(zhì)疏松癥患者近1億，預(yù)計(jì)21世紀(jì)中葉我國發(fā)患者可達(dá)2億。我國50-59歲人口骨質(zhì)疏松癥男性患病率達(dá)14％，女性患病率達(dá)20%，其中女性患者骨折致死的風(fēng)險(xiǎn)達(dá)2.8%，與乳腺癌致死的風(fēng)險(xiǎn)相當(dāng)；60-69歲人口骨質(zhì)疏松癥男性患病率達(dá)30%，女

2、性患病率高達(dá)50%-70%。隨著社會(huì)老齡化的加劇，骨質(zhì)疏松癥發(fā)患者人數(shù)越來越多，其嚴(yán)重后果是脆性骨折，而脆性骨折又加大了老年人的傷殘率與死亡率。因此，防治骨質(zhì)疏松癥已刻不容緩。
　　目前，西藥治療骨質(zhì)疏松主要包括骨礦化藥物、雌激素類、骨形成刺激劑（主要有鈣制劑、雌激素、甲狀旁腺激素、他汀類藥物等）。在短期內(nèi)這些藥物治療骨質(zhì)疏松有一定的療效，但遠(yuǎn)期效果不理想，且具有毒副作用，如雌激素療法能明顯增加乳腺癌的發(fā)病概率。
　　中醫(yī)藥

3、在治療骨質(zhì)疏松和改善患者身心健康方面有很大的優(yōu)勢(shì)。當(dāng)羊骨片源于臨床驗(yàn)方，其療效確切。采用灌服維甲酸的方法建立骨質(zhì)疏松大鼠模型。前期實(shí)驗(yàn)表明，不含鈣制劑當(dāng)羊骨片可以顯著提高去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠的骨鈣含量，增加骨密度。那么，當(dāng)羊骨片如何增加骨鈣含量及骨密度的呢？本實(shí)驗(yàn)擬從骨保護(hù)素（Osteoprotegrin，OPG）/核因子κB受體活化因子（Receptor Activator of NF-κB，RANK）/核因子κB受體活化因子配體（Re

4、ceptor Activator of NF-κB Ligand，RANKL）系統(tǒng)進(jìn)行研究，初步揭示當(dāng)羊骨片治療骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制。
　　目的：本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)當(dāng)羊骨片對(duì)維甲酸致骨質(zhì)疏松大鼠股骨OPG，RANK L，TGF-β1基因表達(dá)及骨組織形態(tài)學(xué)的影響，初步揭示當(dāng)羊骨片治療骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制。
　　方法：
　　1、分組、建模與給藥:6月齡SPF級(jí)雌性SD大鼠60只，隨機(jī)分成六組，每組10只，分別為正常對(duì)照組（N）

5、、維甲酸模型組（MO）、陽性對(duì)照組（XC）、當(dāng)羊骨片低劑量組（L）、當(dāng)羊骨片中劑量組（M）、當(dāng)羊骨片高劑量組（H）。前14 d，除正常對(duì)照組外，其余各組大鼠分別予以維甲酸（7 mg·mL-1）灌胃，各給藥組大鼠分別給予相應(yīng)藥物，當(dāng)羊骨片（低、中、高）劑量組大鼠予以當(dāng)羊骨片（25mg·mL-1，50mg·mL-1，100mg·mL-1）灌胃，陽性對(duì)照組給予仙靈骨葆（31.2mg·mL-1）灌胃，維甲酸模型組大鼠予以同體積的蒸餾水。后14d

6、維甲酸改為同體積的蒸餾水。正常對(duì)照組大鼠全程均予以同體積的蒸餾水灌胃，各溶液灌胃量為10mL·kg-1。
　　2、大鼠體質(zhì)量的監(jiān)測(cè)：分別在建模及藥物干預(yù)的7d、14d、藥物干預(yù)的21d、藥物干預(yù)的28d，稱量各組大鼠的體質(zhì)量。
　　3、取材及預(yù)處理:藥物干預(yù)28d后，按0.5mL/100g腹腔注射4%水合氯醛麻醉大鼠，迅速腹主動(dòng)脈取血5mL，4℃靜置20min，以4000rpm離心15min后取上清液，-80℃冷凍保存?zhèn)溆茫?/p>

7、處死大鼠后，迅速取雙側(cè)大鼠股骨及脛骨，祛除筋膜，生理鹽水清洗，濾紙吸干表面水分后，股骨-80℃冷凍保存?zhèn)溆?，脛骨置?%多聚甲醛中固定。
　　4、指標(biāo)檢測(cè)：酶聯(lián)免疫（Enzyme Linked Immune Sorbent Assay，ELISA）法分別檢測(cè)大鼠血清中OPG、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（Transforming Growth Factor-β1，TGF-β1）、骨鈣素(Osteocalcin，OC)的含量。反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈

8、反應(yīng)（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）法分別檢測(cè)大鼠左側(cè)股骨中OPG、RANKL、TGF-β1mRNA的表達(dá)。稱取大鼠右側(cè)股骨濕重，而后將股骨以氯仿:甲醇混合液(2:1)脫脂72h，置烘箱中120℃干燥6h，冷卻恒重后稱取干重，計(jì)算干重/濕重比值；大鼠右側(cè)脛骨，祛除筋膜，生理鹽水清洗，濾紙吸干表面水分后置于4%多聚甲醛中固定24h，10%EDTA脫鈣42d后，

9、取大鼠右側(cè)脛骨骨骺線下0.5cm，檢測(cè)骨組織形態(tài)學(xué)變化。
　　結(jié)果：
　　1、當(dāng)羊骨片對(duì)OP大鼠體質(zhì)量的影響
　　建模前，各組間大鼠體質(zhì)量無顯著差異(P＞0.05)；建模后，與正常對(duì)照組比較，維甲酸模型組大鼠體質(zhì)量顯著降低(P＜0.05)；與維甲酸模型組比較，當(dāng)羊骨片高劑量組大鼠體質(zhì)量顯著升高(P＜0.05)。
　　2、當(dāng)羊骨片對(duì)OP大鼠骨組織形態(tài)學(xué)的影響
　　正常對(duì)照組可見骨小梁較密集，規(guī)則分布；維甲酸模

10、型組骨小梁變薄、變細(xì)、分布稀疏，斷裂不連接，有的成“紐扣”狀，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)被破壞，成骨細(xì)胞數(shù)明顯減少，破骨細(xì)胞增多，骨髓腔明顯變大且排列不規(guī)則，鈣鹽沉積顯著減少；與維甲酸模型組比較，當(dāng)羊骨片中、高劑量組及陽性對(duì)照組，骨小梁變粗，數(shù)目顯著增加，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)部分恢復(fù)，破骨細(xì)胞減少，成骨細(xì)胞增多，骨髓腔變小且規(guī)則分布，鈣鹽沉積增多。
　　3、當(dāng)羊骨片對(duì)OP大鼠股骨干重/濕重比值的影響
　　與正常對(duì)照組相比，維甲酸模型組大鼠股骨干重/濕重比

11、值顯著降低（P＜0.01）。與維甲酸模型組相比，當(dāng)羊骨片的三個(gè)劑量組及陽性對(duì)照組大鼠股骨干重/濕重比值顯著增加（P＜0.05）。
　　4、當(dāng)羊骨片對(duì)OP大鼠血清OPG、TGF-β1、OC含量的影響
　　與正常對(duì)照組相比，維甲酸模型組大鼠血清OPG含量及TGF-β1含量均顯著降低（P＜0.01），而維甲酸模型組大鼠血清OC含量明顯升高（P＜0.05）。與維甲酸模型組相比，當(dāng)羊骨片中、高劑量組及陽性對(duì)照組大鼠血清OPG含量顯著升

12、高（P＜0.05,P＜0.01）；與維甲酸模型組相比，當(dāng)羊骨片高劑量組及陽性對(duì)照組大鼠血清TGF-β1含量顯著升高（P＜0.05）。當(dāng)羊骨片中、高劑量組及陽性對(duì)照組大鼠血清OC含量與維甲酸模型組比較，顯著降低（P＜0.05）。
　　5、當(dāng)羊骨片對(duì)OP大鼠股骨OPG mRNA、RANKL mRNA、TGF-β1 mRNA表達(dá)水平的影響
　　與正常對(duì)照組相比，維甲酸模型組大鼠股骨OPG mRNA及TGF-β1 mRNA表達(dá)水平顯

13、著降低（P＜0.01），維甲酸模型組大鼠股骨RANKL mRNA表達(dá)水平及RANKL/OPG比值明顯升高（P＜;0.01）。與維甲酸模型組相比，當(dāng)羊骨片中、高劑量組及陽性對(duì)照組大鼠股骨OPG mRNA及TGF-β1mRNA表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），而當(dāng)羊骨片中、高劑量組及陽性對(duì)照組大鼠股骨RANKL/OPG比值較維甲酸模型組明顯降低（P＜0.01），當(dāng)羊骨片三個(gè)劑量組及陽性對(duì)照組大鼠股骨RANKL mRNA表達(dá)水平與維甲酸模型組