FG-NGF膠膜吻合口包埋促進(jìn)周圍神經(jīng)生長的機制研究.pdf

1、研究背景：
　　 周圍神經(jīng)損傷是骨科創(chuàng)傷中的常見病多發(fā)病，占四肢創(chuàng)傷總數(shù)的12.5％。而其中神經(jīng)離斷或嚴(yán)重挫傷、挫滅需手術(shù)治療的病例又在1/2以上。目前周圍神經(jīng)離斷的主要治療手段主要有神經(jīng)直接修復(fù)的手術(shù)和神經(jīng)移植與橋接類手術(shù)。前者主要包括神經(jīng)外膜縫合術(shù)、神經(jīng)束膜縫合術(shù)、神經(jīng)束膜外膜聯(lián)合縫合術(shù)、粘合劑粘合神經(jīng)、激光修復(fù)等。后者主要包括自體神經(jīng)移植術(shù)、異體神經(jīng)移植術(shù)、神經(jīng)轉(zhuǎn)移術(shù)、神經(jīng)端側(cè)吻合術(shù)、生物移植體橋接(骨骼肌、生物膜管、基膜

2、管、幾丁質(zhì)管等)和非生物移植體橋接(硅膠管、碳纖維管)等。
　　 對于神經(jīng)移植與橋接類手術(shù)，由于自體神經(jīng)移植術(shù)和神經(jīng)轉(zhuǎn)移術(shù)需犧牲供取神經(jīng)功能、異體神經(jīng)移植術(shù)存在免疫排斥反應(yīng)、非生物移植體橋接遺留異物需二次手術(shù)取出而生物移植體橋接則大多處于動物實驗階段，所以此類手術(shù)僅限于神經(jīng)有大段缺損或挫滅時嘗試選擇應(yīng)用。對于所見到的大多數(shù)周圍神經(jīng)離斷的病例，目前臨床上采用最多的方法仍然是神經(jīng)直接修復(fù)的方法，陸裕樸等認(rèn)為一般2cm以內(nèi)的缺損可以通

3、過適當(dāng)游離后牽拉而彌補，牽拉延長神經(jīng)的15％～25％，而后可以進(jìn)行直接吻合。
　　 但是，直接修復(fù)的方法由于存在以下缺點和不足仍然效果不夠理想。(1)吻合口容易與周圍組織發(fā)生粘連，形成局部壓迫影響神經(jīng)功能的恢復(fù)。(2)纖維組織侵入吻合口內(nèi)形成疤痕，阻礙再生的神經(jīng)纖維通過吻合口長入神經(jīng)遠(yuǎn)端。(3)局部缺乏富含促進(jìn)神經(jīng)纖維再生與成長的各種生長因子的微環(huán)境，難以形成有利于神經(jīng)纖維再生的“再生室”效應(yīng)。(4)生長受阻的再生神經(jīng)纖維可以在

4、局部形成神經(jīng)纖維瘤。因而，如何尋找一種能夠避免或減少上述缺陷而又操作簡單方便的周圍神經(jīng)修復(fù)方法是目前骨科臨床亟待解決的重要課題。神經(jīng)損傷修復(fù)是多種因素綜合作用的復(fù)雜過程。研究證明吻合口周圍的微環(huán)境是決定周圍神經(jīng)再生與生長的決定因素，許多細(xì)胞因子在神經(jīng)再生過程中起重要作用，研究證明能促進(jìn)神經(jīng)再生的因子主要有：轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)、神經(jīng)生長因子(NGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)、腫瘤壞死因子(TN

5、F)、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)等。
　　 由于內(nèi)源性因子的劑量通常不足以滿足神經(jīng)再生的需要，因此有必要加入外源性的再生促進(jìn)因子。實驗證明，通過這些因子的加入，能明顯促進(jìn)神經(jīng)的再生。其中神經(jīng)生長因子(NGF)是最早發(fā)現(xiàn)和最肯定的細(xì)胞因子。高延明等探討了NGF局部連續(xù)給藥對周圍神經(jīng)損傷后的修復(fù)與再生的影響。結(jié)果表明，NGF局部連續(xù)給藥具有明顯的促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷后的修復(fù)與再生作用；且NGF局部連續(xù)給藥優(yōu)于局部單次給藥。但由

6、于這些因子是具有生物活性的多肽或蛋白質(zhì)，在體內(nèi)極易變性失活，如何在保持活性下進(jìn)行控制釋放也是一個引起人們極大興趣的課題。
　　 本人先期的研究將神經(jīng)生長因子加入到生物蛋白膠的有形成分內(nèi)，使神經(jīng)生長因子在生物蛋白膠配制過程中自然地融于其中，由于二者都是有活性的生物分子，具有相同的生存環(huán)境，不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，因而形成了一種含有神經(jīng)生長因子的生物蛋白膠，將含有NGF的生物蛋白膠包埋大鼠坐骨神經(jīng)吻合口并進(jìn)行：觀察傷肢功能恢復(fù)情況及坐骨神經(jīng)

7、功能指數(shù)；神經(jīng)電生理測定坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度和小腿三頭肌動作電位峰值；形態(tài)學(xué)觀察吻合口粘連情況及神經(jīng)纖維瘤生成情況；吻合口切片光鏡及電鏡觀察再生神經(jīng)纖維數(shù)量，再生神經(jīng)纖維通過率和纖維組織侵入情況及再生神經(jīng)纖維及軸突的直徑、結(jié)構(gòu)和髓鞘厚度。結(jié)果顯示實驗組以上各指標(biāo)均明顯優(yōu)于對照組。作者近年來臨床應(yīng)用本方法治療周圍神經(jīng)離斷患者20余例取得了良好的治療效果。但目前采用該種方法治療周圍神經(jīng)損傷尚缺乏理論依據(jù)，需要從機制方面進(jìn)行探討。為此，作者設(shè)計了

8、本課題研究。
　　 目的：
　　 采用免疫組化、RT-PCR和電鏡等技術(shù)從細(xì)胞、分子生物學(xué)水平探討FG-NGF膠膜在周圍神經(jīng)損傷的吻合口包埋修復(fù)周圍神經(jīng)生長的機制，為該治療方法的有效性提供理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 一、首先建立大鼠坐骨神經(jīng)損傷后吻合口FG-NGF膠膜包埋的動物模型。選用Wistar大鼠，采用股骨后內(nèi)側(cè)切口，于坐骨神經(jīng)分叉處上方約0.5cm處切斷坐骨神經(jīng)，在顯微鏡下吻合。配置含有神經(jīng)生

9、長因子的纖維蛋白膠，均勻噴灑于吻合口周圍。分別于造模后第1，2，4，8周觀察模型情況，同時設(shè)立坐骨神經(jīng)損傷后單純吻合組為對照組。
　　 二、觀察大鼠坐骨神經(jīng)吻合口FG-NGF膠膜包埋對脊髓運動神經(jīng)元的影響。于造模后第2，4，8周多聚甲醛固定后取得實驗組和對照組腰3至骶2節(jié)段的脊髓，冰凍切片，采用HE染色及尼氏染色，顯微鏡下觀察脊髓神經(jīng)元尼氏體、前角神經(jīng)元等形態(tài)結(jié)構(gòu)、數(shù)量的改變。
　　 三、研究FG-NGF膠膜包埋對大鼠坐

10、骨神經(jīng)吻合口雪旺氏細(xì)胞p75水平的影響。結(jié)合酶消化、培養(yǎng)、阿糖胞苷處理和S-100免疫熒光鑒定，取得吻合口的雪旺氏細(xì)胞，進(jìn)行普通培養(yǎng)基和添加高濃度IL-1培養(yǎng)基的培養(yǎng)，檢測不同時間點的雪旺氏細(xì)胞表面神經(jīng)生長因子p75的表達(dá)情況。
　　 四、研究FG-NGF膠膜包埋對坐骨神經(jīng)末端效應(yīng)器官的影響。①在不同時間點沿坐骨神經(jīng)走行方向分離至神經(jīng)肌肉接頭處，獲取0.5×0.5cm的帶有神經(jīng)的新鮮肌肉組織，冰凍切片后AchE抗體免疫組化染色，

11、光鏡下觀察運動終板的數(shù)量。②在不同時間點取神經(jīng)進(jìn)入肌肉部位連同神經(jīng)一起用質(zhì)量濃度為2.5％的戊二醛固定，光鏡下取該部位組織小塊，進(jìn)行再固定、脫水、包埋、切片、染色，電鏡下觀察。
　　 結(jié)果：
　　 造模成功后實驗組和對照組均在第2，4，8周取材比較，免疫組化染色顯示，第2周時兩組脊髓神經(jīng)元均出現(xiàn)形態(tài)結(jié)構(gòu)破壞，染色變淺，核固縮，細(xì)胞突起有的消失，其中對照組神經(jīng)元結(jié)構(gòu)破壞更劇。第4周，兩組神經(jīng)元破壞仍較嚴(yán)重，但實驗組的神經(jīng)膠

12、質(zhì)細(xì)胞增多，神經(jīng)元的形態(tài)較對照組有所恢復(fù)，染色有所變深。第8周這兩個時間點的對照組和實驗組神經(jīng)元的形態(tài)結(jié)構(gòu)差異更大，實驗組脊髓神經(jīng)元形態(tài)趨于規(guī)則、完整，細(xì)胞突起趨于發(fā)達(dá)，尼氏體趨于豐富、染色更深，神經(jīng)元排列趨于整齊。
　　 吻合口的雪旺氏細(xì)胞普通培養(yǎng)基和添加IL-1培養(yǎng)基培養(yǎng)后p75表達(dá)顯示，第1周的實驗組和對照組的雪旺氏細(xì)胞p75表達(dá)水平達(dá)到的高峰值較低，且兩者的峰值相差不大，到達(dá)高峰值的時間較長，但無明顯差異。而第2周的實驗

13、組雪旺氏細(xì)胞p75表達(dá)水平達(dá)到的高峰值較第1周有所增高，達(dá)到高峰值的時間較第1周稍有縮短。而第2周的對照組較第1周的峰值和出現(xiàn)峰值的時間變化不大。第4，8周的雪旺氏細(xì)胞p75表達(dá)水平的峰值較對照組明顯變高，出現(xiàn)峰值的時間明顯提前，兩組具有顯著性差異。
　　 光鏡下觀察見運動終板呈棕褐色“條狀”結(jié)構(gòu)，2周時，實驗組和對照組均顯示運動終板數(shù)量較少，終板染色較淺，形態(tài)多呈不規(guī)則狀。在運動終板的數(shù)量上兩組無明顯差異。4W、8w時試驗組運

14、動終板數(shù)量進(jìn)一步增多，染色加深，延肌纖維分布清晰，對照組運動終板數(shù)量增加，但較實驗組少，且終板形態(tài)呈不規(guī)則狀，染色較淡。兩組存在著明顯差異。
　　 電鏡觀察：2w時可見標(biāo)本變性嚴(yán)重，未能找到神經(jīng)肌肉接頭。骨骼肌細(xì)胞核、肌原纖維、間質(zhì)細(xì)胞退變嚴(yán)重，部分結(jié)構(gòu)腫脹、溶解，成纖維細(xì)胞和大量纖維成分增生。實驗組及對照組無明顯差異。8w時可見少量神經(jīng)肌肉接頭，但數(shù)量較少，無法行統(tǒng)計學(xué)研究。骨骼肌和間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)可見比較清楚及形態(tài)規(guī)整的細(xì)胞核及其