抵抗素作為促炎因子對非酒精性脂肪肝病發(fā)生發(fā)展的影響.pdf

1、目的：
　　模擬非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)體外及體內(nèi)模型，通過觀察抵抗素對肝酶學(xué)指標(biāo)、細(xì)胞和組織形態(tài)學(xué)改變、核因子κB(Nuclear factor-κ3，NF-κB)、腫瘤壞死因子a(tumornecrosis factor-a，TNF-a)表達(dá)及纖維化指標(biāo)的影響，探討抵抗素作為促炎因子對NAFLD發(fā)生發(fā)展的影響。
　　方法：
　　1.體外實(shí)驗(yàn)選

2、用軟脂酸誘導(dǎo)L02細(xì)胞脂肪變性模擬NAFLD體外模型。實(shí)驗(yàn)分為4組：c組(正常對照組)、P組(模型組：軟脂酸20 ug/m1)、CR組(重組人抵抗素50 ug/l)和PR組(軟脂酸20 ug/ml+重組人抵抗素50 ug/l)。各組給予相應(yīng)處理72小時后，油紅O染色觀察細(xì)胞的脂變并測定細(xì)胞培養(yǎng)上清中甘油三酯(TG)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)及谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)的含量；采用半定量RT-PCR及Western blot

3、法檢測細(xì)胞胰島素受體底物-2(IRS-2)、NF-κB、TNF-a的基因及蛋白表達(dá)水平。
　　2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
　　應(yīng)用高脂飲食喂養(yǎng)Wistar大鼠建立NAFLD體內(nèi)模型。健康雄性Wistar大鼠30只，隨機(jī)分為正常對照組和模型組，各15只，分別給予普通飼料和高脂飼料喂養(yǎng)。分別于第15、18、21周末將對照組和模型組隨機(jī)各處理5只。檢測空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FINS)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、透明質(zhì)酸(HA)、Ⅳ型膠原(

4、CIV)、層粘連蛋白(LN)水平，采用穩(wěn)態(tài)模型評估法(HOMA)評估抵抗素抵抗(insulinresistance，IR)(HOMA-IR)；取肝組織HE、VG染色及電鏡觀察肝臟纖維化情況。RT-PCR法檢測大鼠肝組織中抵抗素轉(zhuǎn)錄水平。
　　結(jié)果：
　　1.選用軟脂酸誘導(dǎo)L02細(xì)胞脂肪變性，成功建立NALFD體外模型。
　　(1)油紅O染色觀察：C組肝細(xì)胞邊緣清晰，細(xì)胞核居中，未見明顯橘紅色脂滴形成；P組胞漿內(nèi)可見橘紅

5、色脂滴；CR組胞漿內(nèi)見少量橘紅色脂滴；PR組見大量脂滴，脂滴不同程度融合。
　　(2)與C組比較，P組、CR組及PR組細(xì)胞培養(yǎng)上清中TG、ALT、AST、GGT的含量升高。
　　2.RT-PCR及Western blot結(jié)果顯示：與C組比較，P組、CR組及PR組NF-κB mRNA、TNFαmRNA相對表達(dá)量明顯升高，而。IRS-2mRNA明顯降低(P值均<0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。P組與CR組間比較(P值均>0.05)

6、，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。蛋白質(zhì)相對表達(dá)量變化趨勢同mRNA變化趨勢。
　　3.肝組織形態(tài)學(xué)和血清學(xué)指標(biāo)評價成功建立NAFLD體外模型。
　　(1)隨著造模時間的延長，肝組織病理學(xué)觀察大鼠肝臟脂肪變性及肝纖維化程度逐漸加重。
　　(2)NAFLD模型組HOMA-IR、PCⅢ、LN、CIV、HA隨造模時間延長逐漸增加，均以21周時升高最為明顯，與相應(yīng)時相對照組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。
　　4

7、.RT-PCR結(jié)果示：resistin mRNA變化趨勢同血清學(xué)各項(xiàng)指標(biāo)。
　　5.Spearman相關(guān)性分析顯示抵抗素與HOMA-IR、PCⅢ、LN、CIV、HA呈顯著正相關(guān)(P<0.05或.P<0.01)。
　　結(jié)論：
　　抵抗素上調(diào)脂肪變性LO2細(xì)胞內(nèi)NF-κB和TNF-a的表達(dá)，并且下調(diào)IRS-2的表達(dá)；隨著造模時間的延長，大鼠肝組織抵抗素表達(dá)逐漸升高，并且與血清肝纖維化指標(biāo)和IR成正相關(guān)，提示抵抗素可能通過N